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熒光定量Q-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線優(yōu)化問題
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做了兩鍋梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線 早上的那鍋發(fā)現(xiàn)后面三個低濃度梯度的基本不出峰，或者峰很低 于是下午就從10倍稀釋變?yōu)?倍稀釋 但是結(jié)果顯示曲線的擬合度不好R值從早上的0.94講到0.76了，擴增效率增加了20%； 同時重復(fù)性像是也沒有早上的好， 想問問，一條標(biāo)準(zhǔn)曲線7個標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋梯度夠嗎？ 加完樣，是否要對8聯(lián)管進(jìn)行輕微離心？ 天根的試劑盒上沒寫溶解曲線步驟的溫度程序，設(shè)為 Melt Curve 65.0 to 95.0 C, increment 0.5 C, 0:05 + Plate Read 是否最佳？ 下一步也不知道怎么調(diào)整了 謝謝大牛了  |
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鐵蟲 (初入文壇)
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3樓2011-06-10 10:46:10
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銀蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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silicare(金幣+3, EPI+1): 2011-06-10 12:20:50
churmi(金幣+5): 2011-06-13 21:58:25
silicare(金幣+3, EPI+1): 2011-06-10 12:20:50
churmi(金幣+5): 2011-06-13 21:58:25
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1. 5個點足夠了，但是不能少于5個。R值不能低于0.998 ，否則文章不收。其實這個R值很好做到的。我都是加96孔板，同是做幾條標(biāo)曲，用來測擴增效率。只要每步注意分裝混勻就沒問題，自己先規(guī)劃好。 2.加完樣最好離心，因為8連管在你蓋帽子的時候往往會濺起液滴。 3.溶解曲線程序不是試劑盒決定的，是機器決定的。你機器能支持多高的精度，你實驗需要多高的精度。比如：你如果想知道最后產(chǎn)物的TM精確到0.1°，那你就調(diào)0.1°采一次數(shù)據(jù)，只要你機器能做到。 4.你的實驗，我建議先在紙上把加樣過程寫好，每步加什么，怎么加，加多少。另外，少量的比如：引物模板一定不要一次次加，要大量加然后分裝，否則R值很難達(dá)到。每個設(shè)3個平行。最后，提醒下，要先排除你稀釋產(chǎn)物的操作沒問題，也就是梯度模板沒問題。 |
2樓2011-06-09 13:31:16
4樓2011-06-13 21:59:53
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