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2008116068木蟲 (著名寫手)
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[求助]
PCR擴(kuò)增出現(xiàn)的問題
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我從一個(gè)8K質(zhì)粒上擴(kuò)增一段2.8K的目的片段，無論自己設(shè)計(jì)引物（16到22個(gè)堿基）還是按文獻(xiàn)提供的引物（35和38個(gè)堿基），均擴(kuò)增不出來。已經(jīng)花了一個(gè)月的時(shí)間了，如果再擴(kuò)增不出來，下個(gè)月就要換課題了。 目的片度的特點(diǎn)是GC含量約30%。 各位蟲友，有什么好的建議嗎？對(duì)我來說很重要，就麻煩大家了。 謝謝  |
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好吧，這么說吧： 1。確保你的模板沒有任何問題，質(zhì)粒用試劑盒重新抽提。 2.你要擴(kuò)增的片段是從640-3490，AT含量較高，引物不好設(shè)計(jì)，你應(yīng)該考試試專門針對(duì)AT-rich的擴(kuò)增方法。 3.如果還是不行的話，建議你不要再糾結(jié)于引物擴(kuò)增，而改用酶切回收，看了一下酶切位點(diǎn)還是有很多可以選擇的，提供兩個(gè)和你兩端比較接近的 5‘端： BamHI 2 G/GATCC 635 5578 3'端：SwaI 2 ATTT/AAAT 3470 6123 直接回收635-3470片段大小的， 后面看你想干嘛了，用Taq酶補(bǔ)平加A尾進(jìn)行TA克隆；或者再用你的引物PCR試試，應(yīng)該沒有什么太麻煩的二級(jí)結(jié)構(gòu)了 都試試吧 |
9樓2011-06-18 16:08:37
天使托
專家顧問 (職業(yè)作家)
T.Shen
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2樓2011-06-14 17:48:11
3樓2011-06-14 18:41:43
2008116068
木蟲 (著名寫手)
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目標(biāo)序列為 CTAACTTATAGGGGTAACACTTAAAAAAGAATCAATAACGATAGAAACCGCTCCTAAAGCAGGTGCATTTTTTCCTAACGAAGAAGGCAATAGTTCACATTTATTGTCTAAATGAGAATGGACTCTAGAAGAAACTTCGTTTTTAATCGTATTTAAAACAATGGGATGAGATTCAATTATATGATTTCTCAAGATAACAGCTTCTATATCAAATGTATTAAGGATATTGGTTAATCCAATTCCGATATAAAAGCCAAAGTTTTGAAGTGCATTTAACATTTCTACATCATTTTTATTTGCGCGTTCCACAATCTCTTTTCGAGAAATATTCTTTTCTTCTTTAGAGAGCGAAGCCAGTAACGCTTTTTCAGAAGCATATAATTCCCAACAGCCTCGATTTCCACAGCTGCATTTGGGTCCATTAAAATCTATCGTCATATGACCCATTTCCCCAGAAAAACCCTGAACACCTTTATACAATTCGTTGTTAATAACAAGTCCAGTTCCAATTCCGATATTAATACTGATGTAAACGATGTTTTCATAGTTTTTTGTCATACCAAATACTTTTTCACCGTATGCTCCTGCATTAGCTTCATTTTCAACAAAAACCGGAACATTAAACTCACTCTCAATTAAAAACTGCAAATCTTTGATATTCCAATTTAAGTTAGGCATGAAAATAATTTGCTGATGACGATCTACAAGGCCTGGAACACAAATTCCTATTCCGACTAGACCATAAGGGGACTCAGGCATATGGGTTACAAAACCATGAATAAGTGCAAATAAAATCTCTTTTACTTCACTAGCGGAAGAACTAGACAAGTCAGAAGTCTTCTCGAGAATAATATTTCCTTCTAAGTCGGTTAGAATTCCGTTAAGATAGTCGACTCCTATATCAATACCAATCGAGTAGCCTGCATTCTTATTAAAAACAAGCATTACAGGTCTTCTGCCGCCTCTAGATTGCCCTGCCCCAATTTCAAAAATAAAATCTTTTTCAAGCAGTGTATTTACTTGAGAGGAGACAGTAGACTTGTTTAATCCTGTAATCTCAGAGAGAGTTGCCCTGGAGACAGGGGAGTTCTTCAAAATTTCATCTAATATTAATTTTTGATTCATTTTTTTTACTAAAGCTTGATCTGCAATTTGAATAATAACCACTCCTTTGTTTATCCACCGAACTAAGTTGGTGTTTTTTGAAGCTTGAATTAGATATTTAAAAGTATCATATCTAATATTATAACTAAATTTTCTAAAAAAAACATTGAAATAAACATTTATTTTGTATATGATGAGATAAAGTTAGTTTATTGGATAAACAAACTAACTCAATTAAGATAGTTGATGGATAAACTTGTTCACTTAAATCAAAGGGGGAAATGACAAATGGTCCAAACTAGTGATATCTAAAAATCAAAGGGGGAAATGAGATCTATGGTAAGCCGATACGTACCCGATATGGGCGATCTGATTTGGGTTGATTTTGACCCGACAAAAGGTAGCGAGCAAGCTGGACATCGTCCAGCTGTTGTCCTGAGTCCTTTCATGTACAACAACAAAACAGGTATGTGTCTGTGTGTTCCTTGTACAACGCAATCAAAAGGATATCCGTTCGAAGTTGTTTTATCCGGTCAGGAACGTGATGGCGTAGCGTTAGCTGATCAGGTAAAAAGTATCGCCTGGCGGGCAAGAGGAGCAACGAAGAAAGGAACAGTTGCCCCAGAGGAATTACAACTCATTAAAGCCAAAATTAACGTACTGATTGGGTAGGCATGCTAATGCGGCCGCGAATTCCTGCAGCCCTGGCGAATGGCGATTTTCGTTCGTGAATACATGTTATAATAACTATAACTAATAACGTAACGTGACTGGCAAGAGATATTTTTAAAACAATGAATAGGTTTACACTTACTTTAGTTTTATGGAAATGAAAGATCATATCATATATAATCTAGAATAAAATTAACTAAAATAATTATTATCTAGATAAAAAATTTAGAAGCCAATGAAATCTATAAATAAACTAAATTAAGTTTATTTAATTAACAACTATGGATATAAAATAGGTACTAATCAAAATAGTGAGGAGGATATATTTGAATACATACGAACAAATTAATAAAGTGAAAAAAATACTTCGGAAACATTTAAAAAATAACCTTATTGGTACTTACATGTTTGGATCAGGAGTTGAGAGTGGACTAAAACCAAATAGTGATCTTGACTTTTTAGTCGTCGTATCTGAACCATTGACAGATCAAAGTAAAGAAATACTTATACAAAAAATTAGACCTATTTCAAAAAAAATAGGAGATAAAAGCAACTTACGATATATTGAATTAACAATTATTATTCAGCAAGAAATGGTACCGTGGAATCATCCTCCCAAACAAGAATTTATTTATGGAGAATGGTTACAAGAGCTTTATGAACAAGGATACATTCCTCAGAAGGAATTAAATTCAGATTTAACCATAATGCTTTACCAAGCAAAACGAAAAAATAAAAGAATATACGGAAATTATGACTTAGAGGAATTACTACCTGATATTCCATTTTCTGATGTGAGAAGAGCCATTATGGATTCGTCAGAGGAATTAATAGATAATTATCAGGATGATGAAACCAACTCTATATTAACTTTATGCCGTATGATTTTAACTATGGACACGGGTAAAATCATACCAAAAGATATTGCGGGAAATGCAGTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAGAATTTTGTTAGCAGTTCGTAGTTATCTTGGAGAGAATATTGAATGGACTAATGAAAATGTAAATTTAACTATAAACTATTTAAATAACAGATTAAAAAAATTATAAAAAAATTGAAAAAATGGTGGAAACACTTTTTTCAATTTTTTTGTTTTATTATTTAATATTTGGGAAATATTCATTCTAATTGGTAATCAGATTTTAGAAAACAATAAACCCTTGCATAGGGGGATCTCG |
4樓2011-06-14 22:44:11
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