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[交流] 【求助/交流】熒光PCR擴增曲線問題

我的一對引物探針，高濃度的擴增沒有問題，而低濃度卻擴增不好，熒光信號很低，為什么？圖中那兩條擴增曲線是模板濃度十倍稀釋的！請大家?guī)臀铱纯磁叮?br />

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1樓 2010-12-08 16:59:29

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silicare

榮譽版主 (文壇精英)

love_st(金幣+7):謝謝，我想改變下引物或許有好的結(jié)果 2010-12-09 15:39:13

引用回帖:

Originally posted by love_st at 2010-12-09 11:44:35:

ABI7500的，染料是FAM，熒光值和模板濃度一般也是會呈現(xiàn)梯度下降的，這個下降的太多了，所以圖形很難看，我想知道或者想討論的是，什么因素導(dǎo)致低濃度的擴增效率不高，我想可能是我的引物本身的問題，那么能否改 ...

低濃度模板擴增效率問題是一個普遍的現(xiàn)象，和引物質(zhì)量有直接關(guān)系

1，不管有沒有擴增出目的片段，只要里邊有模板，從第一個循環(huán)開始就會消耗引物，而且模板越多越復(fù)雜，消耗就越大，基因組遠大于質(zhì)粒的消耗。這樣30個循環(huán)下來就消耗了大量的引物，越往后效率越低是難免的

2，引物的初始濃度也不能太高了，太高了就會增加非特異性和二聚體等雜帶

3，如果引物本身的質(zhì)量不是特別好，經(jīng)過30輪的折騰，里邊難免會形成一些引物自身的二級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致引物序列的改變（taq酶是很厲害的，只要有一點點的機會，他也能給你往上添加堿基。這個你應(yīng)該可以理解）

所以，以上三點不難看出，為什么大家都知道低濃度模板擴增效果差，卻無法解決了

貌似你的問題如果想徹底解決，推薦換一對更好的引物。

不過半對數(shù)的圖也行會更好

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9樓2010-12-09 15:10:04

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love_st

金蟲 (著名寫手)

自己頂頂

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2樓2010-12-09 08:41:40

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silicare

榮譽版主 (文壇精英)

love_st(金幣+1):謝謝交流 2010-12-09 08:59:09

做了幾個復(fù)孔啊，第二條明顯不對啊

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3樓2010-12-09 08:50:27

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love_st

金蟲 (著名寫手)

引用回帖:

Originally posted by silicare at 2010-12-09 08:50:27:
做了幾個復(fù)孔啊，第二條明顯不對啊

做了很多重復(fù)，這對引物探針就是這樣，高濃度的模板擴增挺好，就是低濃度的模板突然不呈梯度的熒光信號突然下降的厲害，體系優(yōu)化似乎也優(yōu)化不出來

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4樓2010-12-09 08:58:53

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silicare

榮譽版主 (文壇精英)

最好還是多些數(shù)據(jù)，兩條線不太好分析啊

[ Last edited by silicare on 2010-12-9 at 09:50 ]

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5樓2010-12-09 10:32:21

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love_st

金蟲 (著名寫手)

引用回帖:

Originally posted by silicare at 2010-12-09 10:32:21:
最好還是多些數(shù)據(jù)，兩條線不太好分析啊

[ Last edited by silicare on 2010-12-9 at 09:50 ]

你看下圖

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6樓2010-12-09 12:25:34

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silicare

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love_st(金幣+2): 2010-12-09 12:44:45

什么機子什么染料（探針標(biāo)記染料）啊，熒光值現(xiàn)實好高啊

濃度低了的時候，ct值超過30的時候都容易出現(xiàn)這種情況

不知你這事rn還是delta rn

貌似ct值還比較正常，你換成半對數(shù)圖看看吧，那樣應(yīng)該更直觀好看一些

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7樓2010-12-09 12:32:54

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love_st

金蟲 (著名寫手)

引用回帖:

Originally posted by silicare at 2010-12-09 12:32:54:
什么機子什么染料（探針標(biāo)記染料）啊，熒光值現(xiàn)實好高啊

濃度低了的時候，ct值超過30的時候都容易出現(xiàn)這種情況

不知你這事rn還是delta rn

貌似ct值還比較正常，你換成半對數(shù)圖看看吧，那樣應(yīng)該更直觀好看 ...

ABI7500的，染料是FAM，熒光值和模板濃度一般也是會呈現(xiàn)梯度下降的，這個下降的太多了，所以圖形很難看，我想知道或者想討論的是，什么因素導(dǎo)致低濃度的擴增效率不高，我想可能是我的引物本身的問題，那么能否改變什么條件能改善呢？

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8樓2010-12-09 12:44:35

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wps1234

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很可能是試劑與一起不匹配，重新優(yōu)化下反應(yīng)液吧

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10樓2012-06-07 18:58:54

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wps1234

新蟲 (初入文壇)

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試劑與儀器不匹配，優(yōu)化下反應(yīng)液吧

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11樓2012-06-07 18:59:25

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大甫哥

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我也遇到同樣的問題，我們實驗室的師姐建議我換一種酶試試，可我哪知道換什么酶效果好��？

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12樓2014-06-12 08:32:37

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love_st

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12樓: Originally posted by 大甫哥 at 2014-06-12 08:32:37
我也遇到同樣的問題，我們實驗室的師姐建議我換一種酶試試，可我哪知道換什么酶效果好��？

好點的熱啟動酶，不過這個問題我已經(jīng)解決，換了個引物

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13樓2014-06-12 08:50:39

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大甫哥

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13樓: Originally posted by love_st at 2014-06-12 08:50:39
好點的熱啟動酶，不過這個問題我已經(jīng)解決，換了個引物...

我的是標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，濃度高時無引物二聚體，但當(dāng)降到10^4拷貝就出現(xiàn)引物二聚體了，查詢網(wǎng)上說的有加二甲亞砜的，有說優(yōu)化體系的，還有的說引物二聚體基本難以避免換引物。
優(yōu)化體系你是用正交設(shè)計嗎？還是固定其他條件，只變其中一個？

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14樓2014-06-12 09:50:34

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我用的是taqman探針法，

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15樓2014-06-12 09:55:59

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love_st

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15樓: Originally posted by 大甫哥 at 2014-06-12 09:55:59
我用的是taqman探針法，

探針法你怎么知道有引物二聚體？

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16樓2014-06-12 10:09:03

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16樓: Originally posted by love_st at 2014-06-12 10:09:03
探針法你怎么知道有引物二聚體？...

擴增結(jié)果跑了個膠，發(fā)現(xiàn)低濃度的樣品孔均有大小相同的條帶，

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17樓2014-06-12 10:12:39

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love_st

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17樓: Originally posted by 大甫哥 at 2014-06-12 10:12:39
擴增結(jié)果跑了個膠，發(fā)現(xiàn)低濃度的樣品孔均有大小相同的條帶，...

只要熒光PCR影響不大就OK，如果你也像我上面的情況，建議你更換引物

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18樓2014-06-12 10:21:25

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楓素

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14樓: Originally posted by 大甫哥 at 2014-06-12 09:50:34
我的是標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，濃度高時無引物二聚體，但當(dāng)降到10^4拷貝就出現(xiàn)引物二聚體了，查詢網(wǎng)上說的有加二甲亞砜的，有說優(yōu)化體系的，還有的說引物二聚體基本難以避免換引物。
優(yōu)化體系你是用正交設(shè)計嗎？還是固 ...

我做的也是質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線一直做不好，求教

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19樓2015-07-10 17:47:30

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