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yangzhengnan新蟲 (初入文壇)
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[求助]
熒光pcr標準曲線問題
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| 今天做了一條標準曲線，很奇怪，目的基因模板按2倍稀釋，但是ct值卻相差很小，復孔之間的差別很大，但內(nèi)參復孔間的差別很小，不知各位大俠可不可以給點建議呢？到底是哪里出了問題？ |
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beautybanana
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【答案】應(yīng)助回帖
| 我做了一年多的熒光定量PCR，所以能夠給你些建議：1 稀釋，你大概是用滅菌的去離子水稀釋的吧，一般的用水稀釋，DNA并不能很好的均勻分散在水里，尤其是多次梯度稀釋，模版稀釋10倍，Ct值大約相差3.3，稀釋2倍，那么Ct值本身相差就很小，應(yīng)該是相差1，做標準曲線，模板應(yīng)該10倍梯度稀釋，當多次稀釋的話一般就不能用水了，可以買TaKaRa的EASY dilution進行稀釋，每次稀釋后都要用槍來回吸打數(shù)十次，再稍微離心混勻，這樣才能保證是梯度稀釋，如果沒有EASY Dilution 稀釋液，配置pH8.0的TE緩沖液，一般稀釋到pg級的應(yīng)該是沒有問題的，都很準確，但是到fg級也就是說模板數(shù)在幾十拷貝或幾個拷貝時就不怎么準確了。2 PCR的反應(yīng)體系的體積應(yīng)該大一些，至少是10uL，建議是20uL，這樣誤差就會減少的，當然你加模板的體積一定要準確，加樣的技能一定要熟練。 |
8樓2012-06-24 12:35:41
atlanticwi
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