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yangzhengnan新蟲 (初入文壇)
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熒光pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線問(wèn)題
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| 今天做了一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，很奇怪，目的基因模板按2倍稀釋，但是ct值卻相差很小，復(fù)孔之間的差別很大，但內(nèi)參復(fù)孔間的差別很小，不知各位大俠可不可以給點(diǎn)建議呢？到底是哪里出了問(wèn)題？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
| 我做了一年多的熒光定量PCR，所以能夠給你些建議：1 稀釋，你大概是用滅菌的去離子水稀釋的吧，一般的用水稀釋，DNA并不能很好的均勻分散在水里，尤其是多次梯度稀釋，模版稀釋10倍，Ct值大約相差3.3，稀釋2倍，那么Ct值本身相差就很小，應(yīng)該是相差1，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，模板應(yīng)該10倍梯度稀釋，當(dāng)多次稀釋的話一般就不能用水了，可以買TaKaRa的EASY dilution進(jìn)行稀釋，每次稀釋后都要用槍來(lái)回吸打數(shù)十次，再稍微離心混勻，這樣才能保證是梯度稀釋，如果沒有EASY Dilution 稀釋液，配置pH8.0的TE緩沖液，一般稀釋到pg級(jí)的應(yīng)該是沒有問(wèn)題的，都很準(zhǔn)確，但是到fg級(jí)也就是說(shuō)模板數(shù)在幾十拷貝或幾個(gè)拷貝時(shí)就不怎么準(zhǔn)確了。2 PCR的反應(yīng)體系的體積應(yīng)該大一些，至少是10uL，建議是20uL，這樣誤差就會(huì)減少的，當(dāng)然你加模板的體積一定要準(zhǔn)確，加樣的技能一定要熟練。 |
8樓2012-06-24 12:35:41
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