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[求助] 求助PCR擴(kuò)增試驗(yàn)遇到的問(wèn)題？

引物：27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492r:TACGGYTACCTTGTTACGACTT
反應(yīng)體系：94℃ 2min（94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 90s）30循環(huán)，72℃ 10min，保溫4℃。
大板的那個(gè)是一次電泳圖片，小的是二次PCR電泳圖片，我想送出去測(cè)序，總說(shuō)我的樣品濃度太低，請(qǐng)求各位大俠的指導(dǎo)。

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1樓 2013-11-07 21:00:13

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Hazel張健

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你的marker是？！貌似你的PCR產(chǎn)物不是單一條帶哦~對(duì)圖片再多給點(diǎn)信息~

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2樓2013-11-07 21:32:32

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你可以把DNA重新沉淀啊，這樣DNA就還原了。加dd水溶解的時(shí)候可以少加點(diǎn)dd水。這樣DNA濃度就增大了。擴(kuò)增效果應(yīng)該明顯一點(diǎn)。還有就是配體系的時(shí)候用槍加的量一定要夠。

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4樓2013-11-08 00:51:03

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Lovebirdshs

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建議使用巢式PCR擴(kuò)增，應(yīng)該能夠大幅提高目的片段產(chǎn)量

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孤獨(dú)的舞者

11樓2013-11-10 19:59:36

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笨熊zhou

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濃度太低會(huì)不會(huì)是回收率太低了，也就是試劑盒是不是不太適合，建議換試劑盒試試

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每天對(duì)著鏡子開心一笑

12樓2013-11-10 20:19:53

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非常感謝你的回答，我的這兩個(gè)圖片都沒(méi)有mark，都是樣品的，我以前做過(guò)有mark的，我現(xiàn)在做是想送出去測(cè)序，但是條帶越來(lái)越暗了，送出去的結(jié)果回來(lái)說(shuō)樣品濃度太低，共送出去13個(gè)樣，出來(lái)了6個(gè)，其余的7個(gè)都沒(méi)出來(lái)，反應(yīng)體系25μl，上游引物（10μM)：0.5μl，下游引物（10μM)：0.5μl，無(wú)菌水13μl，預(yù)混液10μl

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3樓2013-11-07 21:46:37

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你的倆個(gè)引物都是細(xì)菌通用引物。應(yīng)該是做微生物的吧。我本科的實(shí)驗(yàn)就用這兩個(gè)引物。其實(shí)，你也可以用PA PB試試的。雖然它是放線菌的引物。還有我想問(wèn)你是塔里木大學(xué)張利莉院長(zhǎng)的學(xué)生麼？

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5樓2013-11-08 00:57:19

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我不是塔里木大學(xué)的學(xué)生，我是做微生物的。

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6樓2013-11-08 08:22:05

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三蟄

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問(wèn)題是marker的信息太少，不過(guò)通過(guò)圖像來(lái)看還不錯(cuò)，濃度應(yīng)該挺好，沒(méi)有marker怎么比對(duì)……上marker信息……

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我不會(huì)！

7樓2013-11-08 09:47:15

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引用回帖:

4樓: Originally posted by 562190113 at 2013-11-08 00:51:03
你可以把DNA重新沉淀啊，這樣DNA就還原了。加dd水溶解的時(shí)候可以少加點(diǎn)dd水。這樣DNA濃度就增大了。擴(kuò)增效果應(yīng)該明顯一點(diǎn)。還有就是配體系的時(shí)候用槍加的量一定要夠。
...

你可以說(shuō)的詳細(xì)點(diǎn)嗎

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8樓2013-11-08 14:33:41

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sun_in_night

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還有跑膠不加marker的啊。。。那你怎么知道跑出來(lái)的條帶是你的要的大��？

PCR產(chǎn)物濃度小的話可以拿你的PCR產(chǎn)物作為模板再做一次PCR，這樣能增加很多濃度。

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9樓2013-11-09 12:23:18

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同意樓上，這個(gè)沒(méi)有marker，怎么判斷所得到的條帶就是你要的目的片段…………

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我不會(huì)！

10樓2013-11-10 18:58:30

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