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lyta0

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[求助] 大片段PCR擴增求助

我要擴增一個片段為3623bp的DNA,條件如下：98℃1分鐘，然后是四十個循環(huán)：98℃10秒，52℃10秒，68℃3分30秒，最后是68℃6分鐘，擴了好幾次都失敗，求助各位高手

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1樓 2012-01-18 18:27:09

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魚山聽濤

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【答案】應助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): 分析得很有道理！ 2012-01-20 14:10:38
lyta0(金幣+5): 2012-01-20 16:07:36

1、如果已知所擴序列，看一下GC含量。如果GC含量高就改用GC buffer。
2、普通Taq擴增3-4 kb條帶沒有問題，如果不放心，可以用Takara的LA Taq。
3、解鏈和退火時間延長到30 sec。
4、Taq系列的擴增速度是2 kb/min，所以你用3.5 min延伸沒有問題，循環(huán)數(shù)改為30即可，過多沒有用處。
5、退火溫度應該根據(jù)引物確定，一般為引物Tm減去5到10度。你沒有批出來，可以考慮降低退火溫度。
6、引物量是否夠？有引物帶嗎？如果沒有，增加引物用量。
7、模板量是否夠？

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書到用時方恨少

14樓2012-01-20 09:31:56

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chenglong_li

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西瓜: 回帖置頂 2012-04-03 15:00:15

引用回帖:

21樓: Originally posted by chenglong_li at 2012-04-02 10:20:51:
問題一樣啊，3kb多的片段，擴了一個月，也沒有好的電泳結果。
我分析或許與所擴增的基因有關系，其高級結果比較復雜，變性時間短的話解鏈不充分，變性時間長的話造成模板損傷，退火溫度高的話引物與模板結合不充 ...

昨天上午看了大家發(fā)的帖，晚上我就p出來了！
Thank all of you very much!

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西瓜

為天地立心，為生民立命，為往圣繼絕學，為萬世開太平。

22樓2012-04-03 08:11:53

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chenglong_li

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★ ★
小丹木木: 回帖置頂 2012-04-05 13:43:12
小丹木木: 金幣+2, 很有幫助 2012-04-05 13:44:55

模板：我用“細菌基因組DNA提取試劑盒”進行了純化;
Taq酶：換用了TaKaRa的Premix Taq Version 2.0(Loading dye mix);
反應：變性時間從1min減為30sec;
希望對大家有所幫助！
再次感謝大家！Thank you!

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為天地立心，為生民立命，為往圣繼絕學，為萬世開太平。

24樓2012-04-05 12:49:25

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【答案】應助回帖

感謝參與，應助指數(shù) +1
lyta0(金幣+5): ★★★很有幫助 2012-01-18 21:13:19

3.6kb并不大，應該不難。
我覺得變性和退火的時間短了點，我們實驗室一般用95℃/30秒變性，55℃/45秒退火，我自己用的是95℃/20秒變性，55℃/30秒退火。上面說的是常用的條件，如果擴增不出來就降低退火溫度，特異性不高就提高退火溫度，一般都能做出來的。
Taq酶每分鐘擴增1kb，延伸時間3分30秒感覺不夠。雖然一般這樣也能做出來，但是既然你沒做出來，我建議延伸時間改成4分鐘。
另外，試劑也可能出問題。你的試劑做其他PCR是否正常呢？

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2樓2012-01-18 18:59:32

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bearjazz

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★
西瓜(金幣+1): 鼓勵應助 2012-01-19 18:13:20

這兩天，我p了一個2700bp的片段，延伸時間7分鐘，退火時間1分鐘，效果不錯，送華大測通，拼接結果

[ 發(fā)自手機版 http://www.gaoyang168.com/3g ]

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沉悶科學的掘墓人

7樓2012-01-19 06:56:47

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lyta0

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引用回帖:

樓: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-18 18:59:32:
3.6kb并不大，應該不難。
我覺得變性和退火的時間短了點，我們實驗室一般用95℃/30秒變性，55℃/45秒退火，我自己用的是95℃/20秒變性，55℃/30秒退火。上面說的是常用的條件，如果擴增不出來就降低退火溫度，特 ...

我現(xiàn)在正在用別人的dNTP和buffer重新PCR,希望能P出來，結果再告訴你，但是我以前也是這個試劑，P1000多bp的就能P出來

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3樓2012-01-18 21:05:55

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西瓜

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3樓: Originally posted by lyta0 at 2012-01-18 21:05:55:
我現(xiàn)在正在用別人的dNTP和buffer重新PCR,希望能P出來，結果再告訴你，但是我以前也是這個試劑，P1000多bp的就能P出來

呵呵，我們是鼓勵反饋的哦~
祝實驗順利哈

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4樓2012-01-19 00:04:46

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樓: Originally posted by 西瓜 at 2012-01-19 00:04:46:
呵呵，我們是鼓勵反饋的哦~
祝實驗順利哈

bad news, 還是沒有問題，證明不是試劑的問題，看來得改條件了

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5樓2012-01-19 01:07:21

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【答案】應助回帖

★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
西瓜(金幣+2): 鼓勵交流~春節(jié)快樂哦~ 2012-01-20 14:09:55

稍長一點的片段，建議用TAKARA的LaTaq。我們用這種酶批出過2萬bp的片段（兩步法），對于3千多的片段，3步法沒問題（我前不久用3步法批出過6千多的片段）。關于PCR程序，再大的片段，變性用94度20秒也足夠了，除非片段中含有高比例GC，對于這種情況，我們一般用TAKARA的高GC含量BUFFER.

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6樓2012-01-19 06:44:09

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★
西瓜(金幣+1): 鼓勵交流 2012-01-19 18:13:37

可以試著加入甘油和DMSO，可代替GC buffer，對長片段擴增尤其是GC含量高的效果很好。另外ＰＣＲ條件用梯度溫度試一下。

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8樓2012-01-19 10:49:17

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★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
西瓜(金幣+2): Good！ 2012-01-19 18:13:55

感覺你這有點問題，我們這PCR P3000 4000 什么的各種沒壓力啊，還是你的酶不給力啊，我們擴質粒環(huán)改點擴4000的太正常了，載體就3000了隨意一個片段也超過1000啊建議換酶實際上TAKARA 的LA TAQ 也一般只是比他們普通的酶保證性高一些，建議用PFU，不知道你是什么模板

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9樓2012-01-19 12:10:49

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樓: Originally posted by 393658000 at 2012-01-19 12:10:49:
感覺你這有點問題，我們這PCR P3000 4000 什么的各種沒壓力啊，還是你的酶不給力啊，我們擴質粒環(huán)改點擴4000的太正常了，載體就3000了隨意一個片段也超過1000啊建議換酶實際上TAKARA 的LA TAQ 也一般只是比他 ...

用的模板是cDNA,酶是Phusion High-Fidelity DNA Polymerase

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10樓2012-01-19 16:29:55

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