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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 大片段PCR擴增求助
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lyta0木蟲 (小有名氣)
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[求助]
大片段PCR擴增求助
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| 我要擴增一個片段為3623bp的DNA,條件如下：98℃1分鐘，然后是四十個循環(huán)：98℃10秒，52℃10秒，68℃3分30秒，最后是68℃6分鐘，擴了好幾次都失敗，求助各位高手 |
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 【分子生物】EPI帖 | 實驗求助 |
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bearjazz
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7樓2012-01-19 06:56:47
西瓜
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【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數(shù) +1
lyta0(金幣+5): ★★★很有幫助 2012-01-18 21:13:19
lyta0(金幣+5): ★★★很有幫助 2012-01-18 21:13:19
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3.6kb并不大，應該不難。 我覺得變性和退火的時間短了點，我們實驗室一般用95℃/30秒變性，55℃/45秒退火，我自己用的是95℃/20秒變性，55℃/30秒退火。上面說的是常用的條件，如果擴增不出來就降低退火溫度，特異性不高就提高退火溫度，一般都能做出來的。 Taq酶每分鐘擴增1kb，延伸時間3分30秒感覺不夠。雖然一般這樣也能做出來，但是既然你沒做出來，我建議延伸時間改成4分鐘。 另外，試劑也可能出問題。你的試劑做其他PCR是否正常呢？ |
2樓2012-01-18 18:59:32
lyta0
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3樓2012-01-18 21:05:55
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4樓2012-01-19 00:04:46
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