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lyta0木蟲 (小有名氣)
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[求助]
大片段PCR擴增求助
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| 我要擴增一個片段為3623bp的DNA,條件如下：98℃1分鐘，然后是四十個循環(huán)：98℃10秒，52℃10秒，68℃3分30秒，最后是68℃6分鐘，擴了好幾次都失敗，求助各位高手 |
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西瓜
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
lyta0(金幣+5): ★★★很有幫助 2012-01-18 21:13:19
lyta0(金幣+5): ★★★很有幫助 2012-01-18 21:13:19
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3.6kb并不大，應(yīng)該不難。 我覺得變性和退火的時間短了點，我們實驗室一般用95℃/30秒變性，55℃/45秒退火，我自己用的是95℃/20秒變性，55℃/30秒退火。上面說的是常用的條件，如果擴增不出來就降低退火溫度，特異性不高就提高退火溫度，一般都能做出來的。 Taq酶每分鐘擴增1kb，延伸時間3分30秒感覺不夠。雖然一般這樣也能做出來，但是既然你沒做出來，我建議延伸時間改成4分鐘。 另外，試劑也可能出問題。你的試劑做其他PCR是否正常呢？ |
2樓2012-01-18 18:59:32
bearjazz
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7樓2012-01-19 06:56:47
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): 分析得很有道理！ 2012-01-20 14:10:38
lyta0(金幣+5): 2012-01-20 16:07:36
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): 分析得很有道理！ 2012-01-20 14:10:38
lyta0(金幣+5): 2012-01-20 16:07:36
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1、如果已知所擴序列，看一下GC含量。如果GC含量高就改用GC buffer。 2、普通Taq擴增3-4 kb條帶沒有問題，如果不放心，可以用Takara的LA Taq。 3、解鏈和退火時間延長到30 sec。 4、Taq系列的擴增速度是2 kb/min，所以你用3.5 min延伸沒有問題，循環(huán)數(shù)改為30即可，過多沒有用處。 5、退火溫度應(yīng)該根據(jù)引物確定，一般為引物Tm減去5到10度。你沒有批出來，可以考慮降低退火溫度。 6、引物量是否夠？有引物帶嗎？如果沒有，增加引物用量。 7、模板量是否夠？ |
14樓2012-01-20 09:31:56
lyta0
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3樓2012-01-18 21:05:55
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4樓2012-01-19 00:04:46
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