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請問qRT-PCR的標準曲線中擴增效率過高是怎么回事 已有3人參與
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我在做4個目的基因和一個內(nèi)參基因qRT-PCR的標準曲線時，擴增效率全部都超過了120%，最高的甚至達到190%。我現(xiàn)在唯一能確定的就是在加樣的過程中不同稀釋梯度（10倍的梯度）的模板cDNA在加樣過程中有相互污染，所以Ct值也不成線性的變化。我現(xiàn)在就是再重新做并嚴格避免污染，但是除了我確定的這個原因，還有其他的一些什么原因可能導致了擴增效率過高呢？ 請有經(jīng)驗的高手指教，非常謝謝！ 還有一個問題，就是我的內(nèi)參基因本身的豐度比其他4個目的基因的高很多，因為即使模板稀釋了10^5倍了，但Ct值也沒有超過20，而其他的目的基因的Ct值都在24到31之間，這種內(nèi)參基因和目的基因本身的豐度懸殊這么大，這樣的內(nèi)參可以用來作為內(nèi)參嗎？是不是找一個與目的基因相當?shù)牟判心兀扛兄x解惑！ |
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atlanticwi
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【答案】應助回帖
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵交流 2014-02-26 08:20:53
wybiology: 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-03-01 15:23:56
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... 1. 引物不合適，不僅僅有擴增效率不夠100%的情況出現(xiàn)，同樣也有擴增效率超過100%的情況，普通認為90~110%的擴增效率比較合適。你的擴增效率過高，你需要在引物上下下工夫。 2. 這樣的內(nèi)參肯定不合適，內(nèi)參有很多，建議第一次做的時候，多上幾個內(nèi)參（3個左右）一起看看比較合適。 祝實驗順利，說的不周之處希望高手指點  |
2樓2014-02-25 20:22:54
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