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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » QPCR之 擴增效率
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shiliyusly新蟲 (小有名氣)
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[求助]
QPCR之 擴增效率
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大家好！之前在壇里發(fā)過帖子對于QPCR學到很多，現(xiàn)在總結(jié)就是擴增效率很重要。 一直有2個問題基因在折磨著我，目前我還沒到絕望到換引物的地步，所以還是想先摸下優(yōu)化條件，因為我引物設計也不熟練，實在是沒有把握能設計個新的好的。 一個是內(nèi)標基因ACT，普通PCR摸的退火溫度是47度，QPCR上做了47度，60度，65度并且引物減半的，圖如下： 現(xiàn)在想請教下高手ACT接下去該怎么摸呢？ 另一個基因是F3'H,溶解曲線有個小峰，空白對照都有小峰，并且峰型和樣品的差不多，兩個峰。 之前60度二步法擴增效率80%，后來我用52度三步法擴增效率達到98%，線性擬合度達0.99多，想問這樣是不是OK呢，顧慮就是溶解曲線有小峰，但是空白對照就是有小峰的，空白和最低稀釋度的峰型基本一樣。有點奇怪。F3'H溶解曲線如下第2個圖： 還麻煩高手指點下啊，謝謝謝謝�。�！ 3個ACT比較圖.jpg 2Z75(V$JY09JG]IP%`PLWZE.jpg |
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 QPCR 問題簡答 |
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cicelyzh
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從F3'H擴增來看，小峰多半是引物二聚體。你說的空白對照峰型和樣品差不多是什么意思？你指空白對照也能有擴增嗎？空白對照出現(xiàn)標準峰的話一般是指樣品有基因組DNA污染。如果我沒記錯，你做的是楊梅？你引物設計的時候是否跨越了內(nèi)含子？如果有跨內(nèi)含子，基因組DNA擴增出來的峰與cDNA的峰應該是不同的。空白對照往往容易出現(xiàn)熔解溫度較低的峰，那是引物二聚體造成的，因為缺少特異擴增，引物二聚體形成會比樣品更嚴重一些。你的這個情況，只能說引物不好。 有一點要說明的是，目標基因和內(nèi)參基因擴增時的退火溫度最好選取一致。因為做定量時需要它們在同樣的條件下擴增。為什么要這么做你大概也是知道的。熒光強度隨著溫度升高是衰減的，這個可以從熔解曲線上看。曲線一直是下降的，當熔解產(chǎn)物時，有很陡的slop出現(xiàn)。所以，做很多基因定量時，引物設計方面除了要考慮特異性和高階結(jié)構(gòu)以外，還要考慮退火溫度大致相同。 從內(nèi)參的三個圖來看，內(nèi)參的引物的問題似乎更大。退火溫度高時CT數(shù)大是正常趨勢，但是圖上熔解溫度高于80°C的有兩個峰。退火溫度越低，前面的峰越大。這個說明很可能引物有非特異擴增。如果你的內(nèi)標出現(xiàn)這種問題，我看換引物是最佳選擇。 |
2樓2013-01-27 03:38:38
shiliyusly
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正常的空白應該沒有擴增，什么都沒有，讀不到CT，擴增曲線是在baseline。當然，這是非常理想的情況，有時候是可以看到空白的擴增曲線稍微有些抬頭的，但整個熒光水平非常低，未到達檢測限。 是否該用F3'H引物你只有自己決定了。反正不是理想的引物。對于ACT，你想摸條件也是可以的。但我覺得吧，你應該在摸條件的同時也訂一下新的引物。 引物合成一般不是很慢吧，你對自己設計引物信心不足這個我可以理解。誰都有這個階段。尤其是做定量的引物，不是能P出來就一定好用的。一般是這樣的，反正引物也不貴，可以對一個基因設計兩三對引物，選效果好的一對做實驗。 |
5樓2013-01-29 01:14:58
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引物設計首先是確定你想要做的退火溫度，這樣大致決定多少堿基數(shù)目。然后決定你要擴增片段的大小，一般定量不要用很大的片段，150bp-500bp。如果你已經(jīng)有不少引物了，這次合成的引物要和那些引物的差不多。然后就是引物序列了。有引物設計軟件幫助。主要是考慮引物的特異性和二級結(jié)構(gòu)問題。這個你也很明白的，特異性就是不要擴出其他基因來。引物不要形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，引物自身及與互補引物之間的相連堿基配對是越少越好的。你做的是真核生物的，一般是從CDS上設計，最好能跨內(nèi)含子。實在不好辦不跨也可以。實在不行，也可以用非翻譯區(qū)的序列�？紤]諸多因素后，往往是在一些引物里面挑1-2對。 這兩個公司都不錯吧，我個人比較喜歡用bio-rad的東西。 |
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shiliyusly7樓2013-01-30 08:53:11
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9樓2013-01-30 11:06:21
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