 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 4228 | 回復(fù): 8 | |||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
shiliyusly新蟲(chóng) (小有名氣)
|
[求助]
QPCR之 擴(kuò)增效率
|
||
|
大家好！之前在壇里發(fā)過(guò)帖子對(duì)于QPCR學(xué)到很多，現(xiàn)在總結(jié)就是擴(kuò)增效率很重要。 一直有2個(gè)問(wèn)題基因在折磨著我，目前我還沒(méi)到絕望到換引物的地步，所以還是想先摸下優(yōu)化條件，因?yàn)槲乙镌O(shè)計(jì)也不熟練，實(shí)在是沒(méi)有把握能設(shè)計(jì)個(gè)新的好的。 一個(gè)是內(nèi)標(biāo)基因ACT，普通PCR摸的退火溫度是47度，QPCR上做了47度，60度，65度并且引物減半的，圖如下： 現(xiàn)在想請(qǐng)教下高手ACT接下去該怎么摸呢？ 另一個(gè)基因是F3'H,溶解曲線有個(gè)小峰，空白對(duì)照都有小峰，并且峰型和樣品的差不多，兩個(gè)峰。 之前60度二步法擴(kuò)增效率80%，后來(lái)我用52度三步法擴(kuò)增效率達(dá)到98%，線性擬合度達(dá)0.99多，想問(wèn)這樣是不是OK呢，顧慮就是溶解曲線有小峰，但是空白對(duì)照就是有小峰的，空白和最低稀釋度的峰型基本一樣。有點(diǎn)奇怪。F3'H溶解曲線如下第2個(gè)圖： 還麻煩高手指點(diǎn)下啊，謝謝謝謝！�。� 3個(gè)ACT比較圖.jpg 2Z75(V$JY09JG]IP%`PLWZE.jpg |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 QPCR 問(wèn)題簡(jiǎn)答 |
» 本帖@通知
» 猜你喜歡
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有300人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有15人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 相對(duì)定量中怎樣提高擴(kuò)增效率
已經(jīng)有5人回復(fù)
- real-time PCR相對(duì)定量2 -△△CT法中用來(lái)判斷擴(kuò)增效率的標(biāo)準(zhǔn)曲線怎么制作？
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 基因引物與內(nèi)參引物
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 各位做qPCR的大俠看過(guò)來(lái)～～～～～～
已經(jīng)有8人回復(fù)
- Realtime PCR 內(nèi)參與目的基因問(wèn)題
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 熒光定量pcr溶解曲線好幾個(gè)峰，但是電泳只有一條目的條帶，怎么回事
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 有關(guān)RT-PCR中的一些困擾的問(wèn)題
已經(jīng)有7人回復(fù)
- RT-qPCR實(shí)驗(yàn)問(wèn)題
已經(jīng)有23人回復(fù)
- 著急！RT-PCR擴(kuò)增效率低，情況很詭異，求助高手幫忙指點(diǎn)
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 關(guān)于qPCR的幾個(gè)問(wèn)題，求解答
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 請(qǐng)教RT-PCR 擴(kuò)增問(wèn)題
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 一個(gè)關(guān)于qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的問(wèn)題。謝謝！
已經(jīng)有12人回復(fù)
- Real-Time PCR加樣過(guò)程中的那些細(xì)節(jié)
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 熒光定量PCR擴(kuò)增效率怎么做？？？？我要被逼瘋了
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 熒光定量擴(kuò)增效率低怎么辦
已經(jīng)有3人回復(fù)
- PCR試劑進(jìn)行大批量配制分裝，卻出現(xiàn)了擴(kuò)增效率低下的結(jié)果。
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 幫我看看這個(gè)溶解qPCR曲線
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】為什么PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度比設(shè)計(jì)時(shí)的要長(zhǎng)很多？
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【求助/交流】實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增效率低該如何改進(jìn)？
已經(jīng)有5人回復(fù)
cicelyzh
鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
- MolEPI: 10
- 應(yīng)助: 1662 (講師)
- 金幣: 8693.8
- 紅花: 72
- 帖子: 3516
- 在線: 456小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1614001
- 注冊(cè): 2012-02-13
- 專業(yè): 生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
|
引物設(shè)計(jì)首先是確定你想要做的退火溫度，這樣大致決定多少堿基數(shù)目。然后決定你要擴(kuò)增片段的大小，一般定量不要用很大的片段，150bp-500bp。如果你已經(jīng)有不少引物了，這次合成的引物要和那些引物的差不多。然后就是引物序列了。有引物設(shè)計(jì)軟件幫助。主要是考慮引物的特異性和二級(jí)結(jié)構(gòu)問(wèn)題。這個(gè)你也很明白的，特異性就是不要擴(kuò)出其他基因來(lái)。引物不要形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，引物自身及與互補(bǔ)引物之間的相連堿基配對(duì)是越少越好的。你做的是真核生物的，一般是從CDS上設(shè)計(jì)，最好能跨內(nèi)含子。實(shí)在不好辦不跨也可以。實(shí)在不行，也可以用非翻譯區(qū)的序列。考慮諸多因素后，往往是在一些引物里面挑1-2對(duì)。 這兩個(gè)公司都不錯(cuò)吧，我個(gè)人比較喜歡用bio-rad的東西。 |
shiliyusly7樓2013-01-30 08:53:11
cicelyzh
鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
- MolEPI: 10
- 應(yīng)助: 1662 (講師)
- 金幣: 8693.8
- 紅花: 72
- 帖子: 3516
- 在線: 456小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1614001
- 注冊(cè): 2012-02-13
- 專業(yè): 生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
shiliyusly: 金幣+3, ★有幫助 2013-01-28 10:05:52
kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2013-01-29 08:30:42
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
shiliyusly: 金幣+3, ★有幫助 2013-01-28 10:05:52
kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2013-01-29 08:30:42
|
從F3'H擴(kuò)增來(lái)看，小峰多半是引物二聚體。你說(shuō)的空白對(duì)照峰型和樣品差不多是什么意思？你指空白對(duì)照也能有擴(kuò)增嗎？空白對(duì)照出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)峰的話一般是指樣品有基因組DNA污染。如果我沒(méi)記錯(cuò)，你做的是楊梅？你引物設(shè)計(jì)的時(shí)候是否跨越了內(nèi)含子？如果有跨內(nèi)含子，基因組DNA擴(kuò)增出來(lái)的峰與cDNA的峰應(yīng)該是不同的�？瞻讓�(duì)照往往容易出現(xiàn)熔解溫度較低的峰，那是引物二聚體造成的，因?yàn)槿鄙偬禺悢U(kuò)增，引物二聚體形成會(huì)比樣品更嚴(yán)重一些。你的這個(gè)情況，只能說(shuō)引物不好。 有一點(diǎn)要說(shuō)明的是，目標(biāo)基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增時(shí)的退火溫度最好選取一致。因?yàn)樽龆繒r(shí)需要它們?cè)谕瑯拥臈l件下擴(kuò)增。為什么要這么做你大概也是知道的。熒光強(qiáng)度隨著溫度升高是衰減的，這個(gè)可以從熔解曲線上看。曲線一直是下降的，當(dāng)熔解產(chǎn)物時(shí)，有很陡的slop出現(xiàn)。所以，做很多基因定量時(shí)，引物設(shè)計(jì)方面除了要考慮特異性和高階結(jié)構(gòu)以外，還要考慮退火溫度大致相同。 從內(nèi)參的三個(gè)圖來(lái)看，內(nèi)參的引物的問(wèn)題似乎更大。退火溫度高時(shí)CT數(shù)大是正常趨勢(shì)，但是圖上熔解溫度高于80°C的有兩個(gè)峰。退火溫度越低，前面的峰越大。這個(gè)說(shuō)明很可能引物有非特異擴(kuò)增。如果你的內(nèi)標(biāo)出現(xiàn)這種問(wèn)題，我看換引物是最佳選擇。 |
2樓2013-01-27 03:38:38
shiliyusly
新蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 265.4
- 散金: 17
- 紅花: 1
- 帖子: 138
- 在線: 71.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1434769
- 注冊(cè): 2011-10-10
- 專業(yè): 食品科學(xué)基礎(chǔ)
3樓2013-01-28 09:53:33
shiliyusly
新蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 265.4
- 散金: 17
- 紅花: 1
- 帖子: 138
- 在線: 71.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1434769
- 注冊(cè): 2011-10-10
- 專業(yè): 食品科學(xué)基礎(chǔ)
|
F3'H的引物我也不知道有沒(méi)有跨內(nèi)含子，直接拿人家SCI收錄文章里的引物�？瞻椎姆搴蜆悠返姆宀畈欢�，的確是這樣有小峰的引物明顯不是很好的，但是它的擴(kuò)增效率已經(jīng)達(dá)到要求了，是不是可以用呢？另外正�？瞻讘�(yīng)該是怎么樣的呢？ ACT我還想試下用63或65度做下擴(kuò)增效率，想說(shuō)這樣會(huì)不會(huì)把非特異性擴(kuò)增降到最小到?jīng)]有呢？ 這樣感覺(jué)我挺拗的，一直強(qiáng)調(diào)要換引物就是不換，主要是因?yàn)檫@樣的時(shí)間點(diǎn)怕引物快遞過(guò)來(lái)有點(diǎn)慢還有就是我對(duì)自己設(shè)計(jì)引物實(shí)在沒(méi)有信心。。。 |
4樓2013-01-28 10:05:41
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 295求調(diào)劑 +5 | 1428151015 2026-03-27 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 一志愿上海理工能源動(dòng)力（085800）310分求調(diào)劑 +3 | zhangmingc 2026-03-27 | 4/200 |
|
|
[考研] 材料292調(diào)劑 +12 | 橘頌思美人 2026-03-23 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 279 分 求調(diào)劑 +4 | 睡個(gè)好覺(jué)_16 2026-03-24 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +6 | 嗯嗯嗯嗯2 2026-03-27 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料求調(diào)劑 +8 | @taotao 2026-03-21 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)一志愿南京師范大學(xué)303求調(diào)劑 +3 | zzffylgg 2026-03-24 | 3/150 |
|
|
|
[考研]
材料學(xué)碩，求調(diào)劑
 6+5
|
糖葫蘆888ll 2026-03-22 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑，一志愿 南京航空航天大學(xué)大學(xué) ，080500材料科學(xué)與工程學(xué)碩 +4 | @taotao 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 316求調(diào)劑 +5 | 江辭666 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 349求調(diào)劑 +4 | 李木子啊哈哈 2026-03-25 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 329求調(diào)劑 +5 | 1() 2026-03-22 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料與化工304求B區(qū)調(diào)劑 +3 | 邱gl 2026-03-26 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +6 | Koxui 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 調(diào)劑310 +3 | 溫柔的晚安 2026-03-25 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 300分，材料，求調(diào)劑，英一數(shù)二 +5 | 超贊的 2026-03-24 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +3 | 余意卿 2026-03-21 | 6/300 |
|
|
|
[考博] 26申博自薦 +3 | whh869393 2026-03-24 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 求老師收我 +3 | zzh16938784 2026-03-23 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿深大，0703化學(xué)，總分302，求調(diào)劑 +4 | 七月-七七 2026-03-21 | 4/200 |
|