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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » QPCR之 擴增效率
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shiliyusly新蟲 (小有名氣)
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[求助]
QPCR之 擴增效率
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大家好！之前在壇里發(fā)過帖子對于QPCR學到很多，現在總結就是擴增效率很重要。 一直有2個問題基因在折磨著我，目前我還沒到絕望到換引物的地步，所以還是想先摸下優(yōu)化條件，因為我引物設計也不熟練，實在是沒有把握能設計個新的好的。 一個是內標基因ACT，普通PCR摸的退火溫度是47度，QPCR上做了47度，60度，65度并且引物減半的，圖如下： 現在想請教下高手ACT接下去該怎么摸呢？ 另一個基因是F3'H,溶解曲線有個小峰，空白對照都有小峰，并且峰型和樣品的差不多，兩個峰。 之前60度二步法擴增效率80%，后來我用52度三步法擴增效率達到98%，線性擬合度達0.99多，想問這樣是不是OK呢，顧慮就是溶解曲線有小峰，但是空白對照就是有小峰的，空白和最低稀釋度的峰型基本一樣。有點奇怪。F3'H溶解曲線如下第2個圖： 還麻煩高手指點下啊，謝謝謝謝！��！ 3個ACT比較圖.jpg 2Z75(V$JY09JG]IP%`PLWZE.jpg |
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 QPCR 問題簡答 |
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shiliyusly
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8樓2013-01-30 09:33:35
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從F3'H擴增來看，小峰多半是引物二聚體。你說的空白對照峰型和樣品差不多是什么意思？你指空白對照也能有擴增嗎？空白對照出現標準峰的話一般是指樣品有基因組DNA污染。如果我沒記錯，你做的是楊梅？你引物設計的時候是否跨越了內含子？如果有跨內含子，基因組DNA擴增出來的峰與cDNA的峰應該是不同的�？瞻讓φ胀菀壮霈F熔解溫度較低的峰，那是引物二聚體造成的，因為缺少特異擴增，引物二聚體形成會比樣品更嚴重一些。你的這個情況，只能說引物不好。 有一點要說明的是，目標基因和內參基因擴增時的退火溫度最好選取一致。因為做定量時需要它們在同樣的條件下擴增。為什么要這么做你大概也是知道的。熒光強度隨著溫度升高是衰減的，這個可以從熔解曲線上看。曲線一直是下降的，當熔解產物時，有很陡的slop出現。所以，做很多基因定量時，引物設計方面除了要考慮特異性和高階結構以外，還要考慮退火溫度大致相同。 從內參的三個圖來看，內參的引物的問題似乎更大。退火溫度高時CT數大是正常趨勢，但是圖上熔解溫度高于80°C的有兩個峰。退火溫度越低，前面的峰越大。這個說明很可能引物有非特異擴增。如果你的內標出現這種問題，我看換引物是最佳選擇。 |
2樓2013-01-27 03:38:38
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4樓2013-01-28 10:05:41
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