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celia2012銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
有關(guān)RT-PCR中的一些困擾的問題
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最近要做RT-PCR實時定量PCR,遇到好多問題需要解決，以前沒接觸過，不知道怎么下手，有以下問題，需各位同胞們幫忙~ 1.實驗室用的是熒光染料法，相對簡單，但特異性差，之前做了幾個，發(fā)圖大家給鑒定一下，是溶解曲線圖 第一張明顯特異性不行，第一張是兩個引物的溶解曲線，看上去靠譜點，不知道大家是怎么分析的，可能原因是什么？ 2.關(guān)于擴增效率，同一樣品同一引物不同時段做出來的結(jié)果有時會相差很大，每次擴增效率是不同的，如何做擴增效率，如何避免擴增效率的影響，具體怎么實施 3.關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)曲線，做標(biāo)準(zhǔn)曲線很麻煩，具體要克隆建庫？ 4.關(guān)于平行，是否一定要做平行，這樣好藥品好多啊，藥品很貴。做的樣多 5.CT值在哪個范圍內(nèi)比較可靠？ 問題有點多，其實還遇到好多問題~做生物實驗真心麻煩啊，還看不著，摸不透，希望有懂的蟲友們幫幫忙~  |
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youlizujuan
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1、第二張溶解曲線沒問題。 2、擴增效率在90%-110%之間都沒問題，每次有差別是正常的�？缮舷抡{(diào)整引物濃度。 3、不一定非要克隆建庫，用標(biāo)準(zhǔn)品也行。還得看你做相對定量還是絕對定量了。 4、每個樣做2-3個平行重復(fù)，省不得的。 5、CT值一般控制在24-38吧。 經(jīng)驗之談。 |
2樓2012-07-31 19:46:57
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流經(jīng)驗，積極應(yīng)助 2012-08-01 14:01:24
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1、第一個沒有明顯的MELT CURVE, 而且每個樣品差異很大，特異性很差， 第二個，樓主兩個引物是什么意思，不是一對特異引物嗎？ 如果是一對特異引物，出現(xiàn)兩個TM，也是不對的即特異性也不夠。 2、擴增效率在90%-110%之間都沒問題，每次有差別是正常的。這就是為什么要做重復(fù)的原因。 3、可以把你的目標(biāo)片段連到載體上，用質(zhì)粒來做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 4、必須做重復(fù)，3個BIOLOGICAL REPLICATION，2個TECHNIQUE REPLICATION。 5、CT值一般控制在24-38吧。 |
3樓2012-07-31 22:32:38
celia2012
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4樓2012-08-01 09:03:28
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5樓2012-08-01 09:04:55
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6樓2012-08-01 09:31:18
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7樓2012-08-01 09:46:19
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celia2012: 金幣+3 2012-08-01 16:19:08
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如果是2對引物的話，你的第二個圖的結(jié)果是很好的。 如果出現(xiàn)第一個圖的結(jié)果，無需看擴增效率，換引物需要。 3個生物學(xué)重復(fù)，例如，你檢測某一植物的抗病性（假設(shè)為感染病毒拷貝數(shù)），你需要從三株這個植物分別取樣（或者從同一植株的三個不同葉片或其他器官取樣），分別提RNA， RT, QPCR. 最后分析各自CT值。 2個技術(shù)重復(fù)，即重復(fù)一次上述實驗（3個生物學(xué)重復(fù)），避免因為操作不當(dāng)或者誤差帶來的影響。 |
8樓2012-08-01 10:26:07
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