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wkl1984金蟲 (小有名氣)
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[求助]
ＲＴ－ＰＣＲ問(wèn)題求助
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做反轉(zhuǎn)錄，按照生工的AMV一步反轉(zhuǎn)錄試劑盒的具體內(nèi)容操作，但是試劑盒不建議用隨機(jī)六聚體引物擴(kuò)增，我正好用隨機(jī)六聚體引物擴(kuò)增了，擴(kuò)增的結(jié)果如下，1為1000kb的marker，2 為ＲＴ－ＰＣＲ產(chǎn)物，marker好像有問(wèn)題。擴(kuò)增條件為 預(yù)變性45° 30min,PCR擴(kuò)增94° 15s ,60° 30s,72° 1min,40個(gè)循環(huán)，終延伸為72°1min。另外，模板ＤＮＡ的量加了3微升，總模板DNA小余1微克。其余按照試劑盒操作。特異性差一點(diǎn)，請(qǐng)大家給出建議 |
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擴(kuò)增條件為 預(yù)變性45° 30min,PCR擴(kuò)增94° 15s ,60° 30s,72° 1min,40個(gè)循環(huán)，終延伸為72°1min。反應(yīng)體系為ddH2o 19微升，2×RT-PCR Buffer 25微升，AMV Rt/taq Mix 1微升，隨機(jī)六聚體引物 2微升，模板DNA 3微升，總體積 50微升。引物為隨機(jī)六聚體引物，購(gòu)買于Takara，配置濃度為0.2微摩爾每升。預(yù)測(cè)得到的PCR的序列長(zhǎng)度為400-500bp，具體的序列我沒(méi)有找到，只是按照構(gòu)建svFv的操作手冊(cè)和參考文獻(xiàn)進(jìn)行，可是為什么文獻(xiàn)上都不給出CDNA的結(jié)果？?jī)H給出了通過(guò)cDNA擴(kuò)增出VH和VL的片段，其中VH和VL的片段大約為350bp,VH的片段為397bp,VL的片段為330bp.并且資料提供說(shuō)按照cDNA合成試劑盒操作。 |
10樓2011-05-04 10:06:25
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