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[交流]
【求助/交流】RT-PCR ，內(nèi)參在哪個(gè)步驟添加以及marker何時(shí)使用及確定？謝謝
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大家好， 準(zhǔn)備做RT-PCR，看了一些資料，但是有些問題還不明； 1. 內(nèi)參一定要用，但是要何時(shí)添加，在哪個(gè)步驟添加。 看到論壇上有說單獨(dú)p，也有說和目的基因一起p，不是很清楚。 得到c DNA后PCR，這個(gè)體系要加入上游引物和下游引物，是不是內(nèi)參就作為對(duì)照，直接P？ 內(nèi)參本身是為了消除差異性，如果單獨(dú)p，是如何消除的呢？如果一起P，結(jié)果出現(xiàn)的條帶又是怎樣的呢？ 2. marker 何時(shí)用，如何選擇？ 提取出RNA后，要電泳鑒定其質(zhì)量，此時(shí)要用marker嘛？ 最終的pcr產(chǎn)物，電泳也要用到marker是嘛？那內(nèi)參怎么用的？ marker是否單獨(dú)一個(gè)孔跑還是要和目的產(chǎn)物混合來跑？ marker是根據(jù)引物的產(chǎn)物長(zhǎng)度來確定的還是目的基因的大小確定？ 3. 別人文獻(xiàn)上有已知引物序列，想要使用它的序列，但是反應(yīng)條件沒有給出，自己要怎么確定條件呢？ 就是在找公司做引物的時(shí)候，需要注意些什么呢？他合成出的引物會(huì)有什么信息不？ 初學(xué)，也沒有師兄師姐帶，要直接學(xué)習(xí)，問的問題可能很幼稚，但希望高手能夠指點(diǎn)。 下面來說下我看到的PCR的過程： 先提取出RNA （注意不要降解），然后分裝，一部分用于電泳等檢測(cè)RNA質(zhì)量，其他4攝氏度保存，保存時(shí)間較短。 RT：按試劑盒操作。 得到的c DNA 4℃保存，保存較久。 PCR：設(shè)置反應(yīng)參數(shù)等。 這個(gè)過程有用到上游引物和下游引物，是不是內(nèi)參如參照一樣，單獨(dú)p？ 最后就是pcr產(chǎn)物的電泳測(cè)定，用到上樣緩沖體系，怎樣確定用？*的上樣緩沖體系呢？ 希望大家給小的一些指點(diǎn) 大恩大德 感激不盡 |
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dhd997(金幣+5): 辛苦。 2011-02-16 10:42:05
dhd997(金幣+5): 辛苦。 2011-02-16 10:42:05
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下面來說下我看到的PCR的過程： 先提取出RNA （注意不要降解），然后分裝，一部分用于電泳等檢測(cè)RNA質(zhì)量，其他4攝氏度保存，保存時(shí)間較短。 RT：按試劑盒操作。 得到的c DNA 4℃保存，保存較久。 PCR：設(shè)置反應(yīng)參數(shù)等。 這個(gè)過程有用到上游引物和下游引物，是不是內(nèi)參如參照一樣，單獨(dú)p？ 最后就是pcr產(chǎn)物的電泳測(cè)定，用到上樣緩沖體系，怎樣確定用？*的上樣緩沖體系呢？ 答：有和前面重復(fù)的問題就不回答了； 提取出來的TotalRNA樣本要保存在-80里面，或者保存在液氮里面，否則很難保存。 cDNA原則上要保存在-20里面，如果短時(shí)間內(nèi)使用完則可保存在4度里。 電泳緩沖液你自己的書上找吧，任何一本基礎(chǔ)的專業(yè)書里都有，TAE我用的比較多，也有用TBE的。各有各的優(yōu)缺點(diǎn)。 最后給你推薦一本書，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，每天放在床頭看吧，上面會(huì)回答你的一切問題，起碼現(xiàn)階段的一切問題都能解決了。 這問題回答的，累死我了。 |
9樓2011-02-15 11:18:49
10樓2011-02-15 11:19:48
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
dhd997(金幣+5): 歡迎討論。 2011-02-16 10:41:37
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dhd997(金幣+5): 歡迎討論。 2011-02-16 10:41:37
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你理解錯(cuò)了 他不是要做real-time定量PCR 而是要做普通的RT-PCR，RT-PCR是要用到內(nèi)參的。 內(nèi)參和目的基因分為兩管PCR。 PCR的程序反應(yīng)循環(huán)數(shù)要小一點(diǎn)，因?yàn)閮?nèi)參是比較模板數(shù)的差異（也就是說你P目的基因時(shí)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組如果加入的模板數(shù)不一致時(shí)，所以要用內(nèi)參來消除加入模板量的差異），而PCR的循環(huán)數(shù)如果達(dá)到一定量的話產(chǎn)物的總量就會(huì)進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)期，也就是說，如果你加入的模板數(shù)量不一致時(shí)，而循環(huán)數(shù)過大的話，P出來的內(nèi)參的產(chǎn)物是一樣多的，凝膠電泳時(shí)的條帶幾乎是差不多亮的，那這樣的話就無法消除模板的差異了。而且P目的基因時(shí)，也要盡可能的少循環(huán)少加模板，否則進(jìn)入平臺(tái)期則無法看出差異。 |
11樓2011-02-15 16:17:25
★
silicare(金幣+1): 謝謝參與 2011-02-12 12:21:26
amaya1545(金幣+4): 2011-02-14 12:58:43
silicare(金幣+1): 謝謝參與 2011-02-12 12:21:26
amaya1545(金幣+4): 2011-02-14 12:58:43
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內(nèi)參基因最好和目的基因一起擴(kuò)，但并不是說放在一個(gè)管里面擴(kuò)，而是分開。內(nèi)參基因一定要有。如果分開擴(kuò)的話，就要在兩次不同的PCR里加量化因子，消除由不同pcr反應(yīng)引起的誤差！定的引物會(huì)有信息的，特別是退火溫度，但是自己最好跑一次常規(guī)的pcr來確定。另外看了你下面的rna的問題，RNA提出出來后應(yīng)該立刻保存在-80度，而不是4度，以及cDNA也應(yīng)該是在-20度！ 祝好運(yùn) |
2樓2011-02-12 01:50:56
3樓2011-02-14 13:01:01
★ ★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
lstt09nk(金幣+3): 感謝回復(fù)，鼓勵(lì)交流 2011-02-15 10:25:21
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
lstt09nk(金幣+3): 感謝回復(fù)，鼓勵(lì)交流 2011-02-15 10:25:21
| 量化因子，你就用你的一個(gè)cdna樣品就可以的，但是必須要包含你所有的基因(內(nèi)參和目的基因)，相當(dāng)于對(duì)照，每個(gè)pcr盤里面都需要，從而計(jì)算出盤與盤之間的誤差并消除他。你看看這篇文章吧，說的很清楚的：qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome biology,2007! |
4樓2011-02-15 00:07:25
5樓2011-02-15 09:40:49
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
amaya1545(金幣+3): 2011-02-15 22:13:55
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amaya1545(金幣+3): 2011-02-15 22:13:55
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1. 內(nèi)參一定要用，但是要何時(shí)添加，在哪個(gè)步驟添加。 看到論壇上有說單獨(dú)p，也有說和目的基因一起p，不是很清楚。 得到c DNA后PCR，這個(gè)體系要加入上游引物和下游引物，是不是內(nèi)參就作為對(duì)照，直接P？ 內(nèi)參本身是為了消除差異性，如果單獨(dú)p，是如何消除的呢？如果一起P，結(jié)果出現(xiàn)的條帶又是怎樣的呢？ 答：我不知道我理解的對(duì)不對(duì)，你既然用到了內(nèi)參就是要做定量PCR了，每個(gè)孔做一個(gè)樣本，每個(gè)樣本原則上要做三個(gè)重復(fù)，內(nèi)參也當(dāng)做一個(gè)樣本來做，同樣三個(gè)重復(fù)�？组g的差異是沒辦法避免的，除非做多重PCR，這對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求就比較高了。如果每個(gè)孔做一對(duì)引物原則上是只有一條條帶的，如果有多個(gè)條帶肯定就是有問題了，要么是引物二聚體要么是非特異擴(kuò)增。 |
6樓2011-02-15 11:05:46
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
dhd997(金幣+5): good 2011-02-16 10:41:13
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dhd997(金幣+5): good 2011-02-16 10:41:13
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2. marker 何時(shí)用，如何選擇？ 提取出RNA后，要電泳鑒定其質(zhì)量，此時(shí)要用marker嘛？ 最終的pcr產(chǎn)物，電泳也要用到marker是嘛？那內(nèi)參怎么用的？ marker是否單獨(dú)一個(gè)孔跑還是要和目的產(chǎn)物混合來跑？ 答：原則上講RNA檢測(cè)質(zhì)量需要用變性膠來跑才行，但大家都懶，就普通的瓊脂糖膠跑一下看看就好了，至于怎么用普通膠跑RNA檢測(cè)竅門說過很多次了，不說了。后面你又說PCR產(chǎn)物跑電泳的問題，既然用了內(nèi)參是做定量PCR為啥還跑電泳檢測(cè)啊，那這里我當(dāng)你是跑普通PCR來回答問題吧，每一個(gè)PCR管跑完了之后當(dāng)一個(gè)樣本，點(diǎn)在一個(gè)孔麗，通常講一張膠如果不是特別的多樣本的話就點(diǎn)一個(gè)Marker就好，用Marker已知大小的條帶來粗略判斷你的目標(biāo)片段對(duì)不對(duì)。Marker的大小需要根據(jù)你目標(biāo)序列的大小來購(gòu)買不同的產(chǎn)品的，因?yàn)楦鱾�(gè)廠家賣的Marker大小不一樣，每種Marker還有很多個(gè)條帶 |
7樓2011-02-15 11:11:49
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
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3. 別人文獻(xiàn)上有已知引物序列，想要使用它的序列，但是反應(yīng)條件沒有給出，自己要怎么確定條件呢？ 就是在找公司做引物的時(shí)候，需要注意些什么呢？他合成出的引物會(huì)有什么信息不？ 答：別人文獻(xiàn)上的引物可以用，如果沒有反應(yīng)條件回來自己摸一下退火溫度或者直接做個(gè)梯度PCR就好了，延伸時(shí)間根據(jù)酶的特性和引物長(zhǎng)度來確定，大略的體系買酶的說明書上有。合成引物你直接給序列告訴合成量就行了，合成出的引物會(huì)給出該引物的序列，OD，長(zhǎng)度，TM等一些信息，但我一般不用，就用引物計(jì)算器算一下就可以了。 |
8樓2011-02-15 11:14:41
12樓2011-02-15 22:10:27
13樓2011-02-15 22:17:11
14樓2011-02-17 11:19:54
15樓2011-12-28 22:47:28
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