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[交流]
【求助/交流】RT-PCR ，內(nèi)參在哪個步驟添加以及marker何時使用及確定？謝謝
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大家好， 準(zhǔn)備做RT-PCR，看了一些資料，但是有些問題還不明； 1. 內(nèi)參一定要用，但是要何時添加，在哪個步驟添加。 看到論壇上有說單獨p，也有說和目的基因一起p，不是很清楚。 得到c DNA后PCR，這個體系要加入上游引物和下游引物，是不是內(nèi)參就作為對照，直接P？ 內(nèi)參本身是為了消除差異性，如果單獨p，是如何消除的呢？如果一起P，結(jié)果出現(xiàn)的條帶又是怎樣的呢？ 2. marker 何時用，如何選擇？ 提取出RNA后，要電泳鑒定其質(zhì)量，此時要用marker嘛？ 最終的pcr產(chǎn)物，電泳也要用到marker是嘛？那內(nèi)參怎么用的？ marker是否單獨一個孔跑還是要和目的產(chǎn)物混合來跑？ marker是根據(jù)引物的產(chǎn)物長度來確定的還是目的基因的大小確定？ 3. 別人文獻上有已知引物序列，想要使用它的序列，但是反應(yīng)條件沒有給出，自己要怎么確定條件呢？ 就是在找公司做引物的時候，需要注意些什么呢？他合成出的引物會有什么信息不？ 初學(xué)，也沒有師兄師姐帶，要直接學(xué)習(xí)，問的問題可能很幼稚，但希望高手能夠指點。 下面來說下我看到的PCR的過程： 先提取出RNA （注意不要降解），然后分裝，一部分用于電泳等檢測RNA質(zhì)量，其他4攝氏度保存，保存時間較短。 RT：按試劑盒操作。 得到的c DNA 4℃保存，保存較久。 PCR：設(shè)置反應(yīng)參數(shù)等。 這個過程有用到上游引物和下游引物，是不是內(nèi)參如參照一樣，單獨p？ 最后就是pcr產(chǎn)物的電泳測定，用到上樣緩沖體系，怎樣確定用？*的上樣緩沖體系呢？ 希望大家給小的一些指點 大恩大德 感激不盡 |
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dhd997(金幣+5): 辛苦。 2011-02-16 10:42:05
dhd997(金幣+5): 辛苦。 2011-02-16 10:42:05
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下面來說下我看到的PCR的過程： 先提取出RNA （注意不要降解），然后分裝，一部分用于電泳等檢測RNA質(zhì)量，其他4攝氏度保存，保存時間較短。 RT：按試劑盒操作。 得到的c DNA 4℃保存，保存較久。 PCR：設(shè)置反應(yīng)參數(shù)等。 這個過程有用到上游引物和下游引物，是不是內(nèi)參如參照一樣，單獨p？ 最后就是pcr產(chǎn)物的電泳測定，用到上樣緩沖體系，怎樣確定用？*的上樣緩沖體系呢？ 答：有和前面重復(fù)的問題就不回答了； 提取出來的TotalRNA樣本要保存在-80里面，或者保存在液氮里面，否則很難保存。 cDNA原則上要保存在-20里面，如果短時間內(nèi)使用完則可保存在4度里。 電泳緩沖液你自己的書上找吧，任何一本基礎(chǔ)的專業(yè)書里都有，TAE我用的比較多，也有用TBE的。各有各的優(yōu)缺點。 最后給你推薦一本書，分子克隆實驗指南，每天放在床頭看吧，上面會回答你的一切問題，起碼現(xiàn)階段的一切問題都能解決了。 這問題回答的，累死我了。 |
9樓2011-02-15 11:18:49
★
silicare(金幣+1): 謝謝參與 2011-02-12 12:21:26
amaya1545(金幣+4): 2011-02-14 12:58:43
silicare(金幣+1): 謝謝參與 2011-02-12 12:21:26
amaya1545(金幣+4): 2011-02-14 12:58:43
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內(nèi)參基因最好和目的基因一起擴，但并不是說放在一個管里面擴，而是分開。內(nèi)參基因一定要有。如果分開擴的話，就要在兩次不同的PCR里加量化因子，消除由不同pcr反應(yīng)引起的誤差！定的引物會有信息的，特別是退火溫度，但是自己最好跑一次常規(guī)的pcr來確定。另外看了你下面的rna的問題，RNA提出出來后應(yīng)該立刻保存在-80度，而不是4度，以及cDNA也應(yīng)該是在-20度！ 祝好運 |
2樓2011-02-12 01:50:56
3樓2011-02-14 13:01:01
★ ★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
lstt09nk(金幣+3): 感謝回復(fù)，鼓勵交流 2011-02-15 10:25:21
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
lstt09nk(金幣+3): 感謝回復(fù)，鼓勵交流 2011-02-15 10:25:21
| 量化因子，你就用你的一個cdna樣品就可以的，但是必須要包含你所有的基因(內(nèi)參和目的基因)，相當(dāng)于對照，每個pcr盤里面都需要，從而計算出盤與盤之間的誤差并消除他。你看看這篇文章吧，說的很清楚的：qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome biology,2007! |
4樓2011-02-15 00:07:25
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