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孫啟亮金蟲(chóng) (著名寫手)
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[交流]
發(fā)現(xiàn)了beta actin作為內(nèi)參的一個(gè)漏洞
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眾所周知，β-actin作為基因定量或定性的內(nèi)參，在PCR實(shí)驗(yàn)中有著廣泛應(yīng)用。但是小蟲(chóng)在對(duì)人β-actin（gene ID:60，以下簡(jiǎn)稱ACTB）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的時(shí)候，利用primer-blast對(duì)引物分析的時(shí)候發(fā)現(xiàn)引物除了能擴(kuò)增出ACTB外，還能擴(kuò)增出一個(gè)編碼POTE錨蛋白域家族（gene ID：445582）的基因，于是小蟲(chóng)對(duì)倆基因進(jìn)行了blast，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ACTB cDNA全序列與POTE錨蛋白家族基因CDNA部分序列有著驚人的相似！下面是詳細(xì)結(jié)果： 1.首先，ACTB和POTE錨蛋白基因ID不同，證明這完全是兩個(gè)不同的基因 這是ACTB的ID 這是POTE的ID 2.其次，倆基因blast結(jié)果顯示ACTB的全CDNA序列與POTE部分CDNA序列有著驚人的相似度 倆基因的blast結(jié)果 3.再次，正因?yàn)閭z基因的相似，所以在對(duì)人ACTB進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的時(shí)候總是能擴(kuò)增出POTE的部分片段，雖然擴(kuò)增產(chǎn)物大小相同結(jié)構(gòu)也極相似，但是由于他們是兩個(gè)不同的基因，所以在已ACTB作為內(nèi)參的時(shí)候?qū)嶋H上增加了初始模板量，這就不是對(duì)定量產(chǎn)生錯(cuò)誤嗎？ 對(duì)我設(shè)計(jì)的人ACTB引物進(jìn)行primer-blast結(jié)果，因?yàn)槠扔诒Ｃ�，所以未上傳我的引物序�?/font> 最后，基于我碰到的問(wèn)題，有蟲(chóng)友能解釋一下嗎？同時(shí)因?yàn)檫@個(gè)問(wèn)題如果得不到解釋會(huì)對(duì)很多人的科研情況產(chǎn)生影響，所以建議版主將此帖強(qiáng)調(diào)一下，謝謝 [ Last edited by 孫啟亮 on 2012-3-3 at 21:37 ] |
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tianping
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小木蟲(chóng)(金幣+0.5): 給個(gè)紅包，謝謝回帖
西瓜: 回帖置頂 2012-03-31 16:56:49
西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, 學(xué)習(xí)了~ 2012-03-31 16:57:14
小木蟲(chóng)(金幣+0.5): 給個(gè)紅包，謝謝回帖
西瓜: 回帖置頂 2012-03-31 16:56:49
西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, 學(xué)習(xí)了~ 2012-03-31 16:57:14
| 常用看家基因，比如18s,gapdh, beta-actin等，并不一定適合用來(lái)做定量，已經(jīng)有許多文章討論這個(gè)問(wèn)題了。在2003年左右芯片技術(shù)正紅的時(shí)候，已經(jīng)有文章探討如何從芯片數(shù)據(jù)中挖掘更多的看家基因，這方面的文章許多發(fā)表在bmc molecular biology上，并且開(kāi)發(fā)出了geNorm,NormFinder, BestKeeper等軟件來(lái)評(píng)估最穩(wěn)定最適合用來(lái)做QPCR reference的基因。當(dāng)然，那些文章的出發(fā)點(diǎn)是常用看家基因在某些條件下并不穩(wěn)定，或者存在paralog會(huì)導(dǎo)致不適合做reference。你這兒的發(fā)現(xiàn)可能與基因存在paralog的情況差不多，如果actin與pote相似性那么高，有可能是homolog，這種情況actin可能并不適合做定量的對(duì)照基因。 |
16樓2012-03-14 23:57:54
23樓2013-08-19 19:34:47
exon2002
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孫啟亮(金幣+1):謝謝參與
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| 對(duì)樓主的細(xì)心表示很敬佩！這確實(shí)是一個(gè)問(wèn)題了。我的看法有二，其一是要查一下POTE與b-actin的關(guān)系，二者是否有生物學(xué)同源性。來(lái)自于同一個(gè)基因或進(jìn)化上的部分保留的情況常見(jiàn)。甚至在翻譯后做了某種修飾就成了另外一種蛋白去行使不同或相似的功能的情況也常見(jiàn)。其二，即使兩個(gè)蛋白的序列及其相似，使得我們的內(nèi)參不如以前想象的那么清晰，但是以總體作為內(nèi)參也有效，只是其真正的來(lái)源不明朗而已。這個(gè)疑問(wèn)可以通過(guò)基因表達(dá)調(diào)查而澄清。所以用b-actin做內(nèi)參的同仁不必驚慌。 |
5樓2012-03-04 05:39:31
quiller2000
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孫啟亮(金幣+1):謝謝參與
wanhscn(金幣+4, 專家考核): 理解夠全面深入，表示佩服！ 2012-03-05 20:23:52
孫啟亮(金幣+1):謝謝參與
wanhscn(金幣+4, 專家考核): 理解夠全面深入，表示佩服！ 2012-03-05 20:23:52
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實(shí)際上很多的reference gene現(xiàn)在都被證明并不是萬(wàn)能的，因此，一般在選擇內(nèi)參的時(shí)候要選擇在當(dāng)前的條件下或者正在研究的細(xì)胞響應(yīng)過(guò)程中是保持穩(wěn)定的，這一點(diǎn)兒在細(xì)菌中非常常見(jiàn)。正因?yàn)槿绱�，很多課題組現(xiàn)在都采用兩個(gè)或者三個(gè)內(nèi)參。 其次，nb在分析基因表達(dá)調(diào)控方面還是有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)的，因?yàn)椴煌琺RNA的RT的差異非常非常大。 PS，真核生物的不了解，但是，多細(xì)胞生物中，不同細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄水平也是有著相當(dāng)驚人的差異的；因此，總RNA來(lái)源的數(shù)據(jù)，有的時(shí)候很難給一個(gè)合理的解釋 |
6樓2012-03-04 09:37:28
孫啟亮
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8樓2012-03-04 10:16:38
孫啟亮
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17樓2012-03-15 08:19:13
cindybrella
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2樓2012-03-03 21:39:59
孫啟亮
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孫啟亮
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11樓2012-03-06 09:15:44
justdilo
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13樓2012-03-06 17:05:38
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孫啟亮(金幣+1):謝謝參與
送鮮花一朵
孫啟亮(金幣+1): 謝謝參與討論 2012-03-06 18:52:07
孫啟亮(金幣+1):謝謝參與
送鮮花一朵孫啟亮(金幣+1): 謝謝參與討論 2012-03-06 18:52:07
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14樓2012-03-06 18:45:04
15樓2012-03-14 11:45:22
atlanticwi
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
送鮮花一朵
西瓜: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2012-03-31 16:57:57
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
送鮮花一朵西瓜: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2012-03-31 16:57:57
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嗯........ 剛從qPCR的貼子轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)  這些實(shí)驗(yàn)都是針對(duì)Homo Sapiens的嗎？我是做植物的，不是太了解 查了查資料，POTE蛋白的作用現(xiàn)在還是未知是嗎，看到說(shuō)其是在癌癥細(xì)胞中才會(huì)存在，正常體內(nèi)豐度很低？（不了解這個(gè)領(lǐng)域，不知這樣說(shuō)是否合適） 這個(gè)網(wǎng)站似乎只是從結(jié)構(gòu)上推斷了兩者聯(lián)系http://www.biograph.be/concept/graph/C1384510/C1837146 還有這么一篇文獻(xiàn)： A primate-specific POTE-actin fusion protein plays a role in apoptosis 不知是否有何暗示呢.......對(duì)這個(gè)問(wèn)題很感興趣，但非相關(guān)專業(yè)很吃力，希望能看到樓主在這個(gè)問(wèn)題上的進(jìn)展  |
18樓2012-03-30 22:31:41
decloud
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
西瓜: 金幣+3, Can't agree more~ 2012-03-31 16:59:28
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
西瓜: 金幣+3, Can't agree more~ 2012-03-31 16:59:28
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ACTB expression might be slightly increased in cancer cells. And for your question, i would recommend to check whether they are the same one but with different names. If not same, check about the mRNA expression of ACTB and POTE in cells. Last, you have some problem with your designed primers. PCR is very sensitive, once you design a specific primer against ACTB (100% complementary and control the length to make the primer is specifically designed)gene and well control of the PCR condition, there really should not have non specific amplification. |
19樓2012-03-31 12:54:25
孫啟亮
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20樓2012-03-31 13:11:16
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21樓2012-04-01 18:04:24
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26樓2014-12-26 16:14:26
簡(jiǎn)單回復(fù)
2012-03-04 14:52
回復(fù)
孫啟亮(金幣+1):謝謝參與
孫啟亮12樓
2012-03-06 09:32
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