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發(fā)現(xiàn)了beta actin作為內(nèi)參的一個漏洞
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眾所周知，β-actin作為基因定量或定性的內(nèi)參，在PCR實驗中有著廣泛應(yīng)用。但是小蟲在對人β-actin（gene ID:60，以下簡稱ACTB）進行引物設(shè)計的時候，利用primer-blast對引物分析的時候發(fā)現(xiàn)引物除了能擴增出ACTB外，還能擴增出一個編碼POTE錨蛋白域家族（gene ID：445582）的基因，于是小蟲對倆基因進行了blast，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ACTB cDNA全序列與POTE錨蛋白家族基因CDNA部分序列有著驚人的相似！下面是詳細結(jié)果： 1.首先，ACTB和POTE錨蛋白基因ID不同，證明這完全是兩個不同的基因 這是ACTB的ID 這是POTE的ID 2.其次，倆基因blast結(jié)果顯示ACTB的全CDNA序列與POTE部分CDNA序列有著驚人的相似度 倆基因的blast結(jié)果 3.再次，正因為倆基因的相似，所以在對人ACTB進行引物設(shè)計的時候總是能擴增出POTE的部分片段，雖然擴增產(chǎn)物大小相同結(jié)構(gòu)也極相似，但是由于他們是兩個不同的基因，所以在已ACTB作為內(nèi)參的時候?qū)嶋H上增加了初始模板量，這就不是對定量產(chǎn)生錯誤嗎？ 對我設(shè)計的人ACTB引物進行primer-blast結(jié)果，因為迫于保密，所以未上傳我的引物序列 最后，基于我碰到的問題，有蟲友能解釋一下嗎？同時因為這個問題如果得不到解釋會對很多人的科研情況產(chǎn)生影響，所以建議版主將此帖強調(diào)一下，謝謝 [ Last edited by 孫啟亮 on 2012-3-3 at 21:37 ] |
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quiller2000
木蟲 (著名寫手)
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★ ★ ★ ★ ★
孫啟亮(金幣+1):謝謝參與
wanhscn(金幣+4, 專家考核): 理解夠全面深入，表示佩服！ 2012-03-05 20:23:52
孫啟亮(金幣+1):謝謝參與
wanhscn(金幣+4, 專家考核): 理解夠全面深入，表示佩服！ 2012-03-05 20:23:52
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實際上很多的reference gene現(xiàn)在都被證明并不是萬能的，因此，一般在選擇內(nèi)參的時候要選擇在當(dāng)前的條件下或者正在研究的細胞響應(yīng)過程中是保持穩(wěn)定的，這一點兒在細菌中非常常見。正因為如此，很多課題組現(xiàn)在都采用兩個或者三個內(nèi)參。 其次，nb在分析基因表達調(diào)控方面還是有著獨特的優(yōu)勢的，因為不同mRNA的RT的差異非常非常大。 PS，真核生物的不了解，但是，多細胞生物中，不同細胞之間的轉(zhuǎn)錄水平也是有著相當(dāng)驚人的差異的；因此，總RNA來源的數(shù)據(jù)，有的時候很難給一個合理的解釋 |
6樓2012-03-04 09:37:28
簡單回復(fù)
2012-03-04 14:52
回復(fù)
孫啟亮(金幣+1):謝謝參與
孫啟亮12樓
2012-03-06 09:32
回復(fù)
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