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發(fā)現(xiàn)了beta actin作為內參的一個漏洞
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眾所周知，β-actin作為基因定量或定性的內參，在PCR實驗中有著廣泛應用。但是小蟲在對人β-actin（gene ID:60，以下簡稱ACTB）進行引物設計的時候，利用primer-blast對引物分析的時候發(fā)現(xiàn)引物除了能擴增出ACTB外，還能擴增出一個編碼POTE錨蛋白域家族（gene ID：445582）的基因，于是小蟲對倆基因進行了blast，結果發(fā)現(xiàn)ACTB cDNA全序列與POTE錨蛋白家族基因CDNA部分序列有著驚人的相似！下面是詳細結果： 1.首先，ACTB和POTE錨蛋白基因ID不同，證明這完全是兩個不同的基因 這是ACTB的ID 這是POTE的ID 2.其次，倆基因blast結果顯示ACTB的全CDNA序列與POTE部分CDNA序列有著驚人的相似度 倆基因的blast結果 3.再次，正因為倆基因的相似，所以在對人ACTB進行引物設計的時候總是能擴增出POTE的部分片段，雖然擴增產物大小相同結構也極相似，但是由于他們是兩個不同的基因，所以在已ACTB作為內參的時候實際上增加了初始模板量，這就不是對定量產生錯誤嗎？ 對我設計的人ACTB引物進行primer-blast結果，因為迫于保密，所以未上傳我的引物序列 最后，基于我碰到的問題，有蟲友能解釋一下嗎？同時因為這個問題如果得不到解釋會對很多人的科研情況產生影響，所以建議版主將此帖強調一下，謝謝 [ Last edited by 孫啟亮 on 2012-3-3 at 21:37 ] |
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23樓2013-08-19 19:34:47
5樓2012-03-04 05:39:31
★ ★ ★ ★ ★
孫啟亮(金幣+1):謝謝參與
wanhscn(金幣+4, 專家考核): 理解夠全面深入，表示佩服！ 2012-03-05 20:23:52
孫啟亮(金幣+1):謝謝參與
wanhscn(金幣+4, 專家考核): 理解夠全面深入，表示佩服！ 2012-03-05 20:23:52
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實際上很多的reference gene現(xiàn)在都被證明并不是萬能的，因此，一般在選擇內參的時候要選擇在當前的條件下或者正在研究的細胞響應過程中是保持穩(wěn)定的，這一點兒在細菌中非常常見。正因為如此，很多課題組現(xiàn)在都采用兩個或者三個內參。 其次，nb在分析基因表達調控方面還是有著獨特的優(yōu)勢的，因為不同mRNA的RT的差異非常非常大。 PS，真核生物的不了解，但是，多細胞生物中，不同細胞之間的轉錄水平也是有著相當驚人的差異的；因此，總RNA來源的數據，有的時候很難給一個合理的解釋 |
6樓2012-03-04 09:37:28
8樓2012-03-04 10:16:38
17樓2012-03-15 08:19:13
2樓2012-03-03 21:39:59
3樓2012-03-03 21:41:53
4樓2012-03-04 01:58:11
7樓2012-03-04 10:11:01
10樓2012-03-04 16:26:22
11樓2012-03-06 09:15:44
13樓2012-03-06 17:05:38
★ ★
孫啟亮(金幣+1):謝謝參與
送鮮花一朵
孫啟亮(金幣+1): 謝謝參與討論 2012-03-06 18:52:07
孫啟亮(金幣+1):謝謝參與
送鮮花一朵孫啟亮(金幣+1): 謝謝參與討論 2012-03-06 18:52:07
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本帖內容被屏蔽 |
14樓2012-03-06 18:45:04
15樓2012-03-14 11:45:22
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5): 給個紅包，謝謝回帖
西瓜: 回帖置頂 2012-03-31 16:56:49
西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, 學習了~ 2012-03-31 16:57:14
小木蟲(金幣+0.5): 給個紅包，謝謝回帖
西瓜: 回帖置頂 2012-03-31 16:56:49
西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, 學習了~ 2012-03-31 16:57:14
| 常用看家基因，比如18s,gapdh, beta-actin等，并不一定適合用來做定量，已經有許多文章討論這個問題了。在2003年左右芯片技術正紅的時候，已經有文章探討如何從芯片數據中挖掘更多的看家基因，這方面的文章許多發(fā)表在bmc molecular biology上，并且開發(fā)出了geNorm,NormFinder, BestKeeper等軟件來評估最穩(wěn)定最適合用來做QPCR reference的基因。當然，那些文章的出發(fā)點是常用看家基因在某些條件下并不穩(wěn)定，或者存在paralog會導致不適合做reference。你這兒的發(fā)現(xiàn)可能與基因存在paralog的情況差不多，如果actin與pote相似性那么高，有可能是homolog，這種情況actin可能并不適合做定量的對照基因。 |
16樓2012-03-14 23:57:54
★ ★ ★ ★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
送鮮花一朵
西瓜: 金幣+3, 鼓勵交流 2012-03-31 16:57:57
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
送鮮花一朵西瓜: 金幣+3, 鼓勵交流 2012-03-31 16:57:57
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嗯........ 剛從qPCR的貼子轉過來  這些實驗都是針對Homo Sapiens的嗎？我是做植物的，不是太了解 查了查資料，POTE蛋白的作用現(xiàn)在還是未知是嗎，看到說其是在癌癥細胞中才會存在，正常體內豐度很低？（不了解這個領域，不知這樣說是否合適） 這個網站似乎只是從結構上推斷了兩者聯(lián)系http://www.biograph.be/concept/graph/C1384510/C1837146 還有這么一篇文獻： A primate-specific POTE-actin fusion protein plays a role in apoptosis 不知是否有何暗示呢.......對這個問題很感興趣，但非相關專業(yè)很吃力，希望能看到樓主在這個問題上的進展  |
18樓2012-03-30 22:31:41
★ ★ ★ ★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
西瓜: 金幣+3, Can't agree more~ 2012-03-31 16:59:28
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
西瓜: 金幣+3, Can't agree more~ 2012-03-31 16:59:28
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ACTB expression might be slightly increased in cancer cells. And for your question, i would recommend to check whether they are the same one but with different names. If not same, check about the mRNA expression of ACTB and POTE in cells. Last, you have some problem with your designed primers. PCR is very sensitive, once you design a specific primer against ACTB (100% complementary and control the length to make the primer is specifically designed)gene and well control of the PCR condition, there really should not have non specific amplification. |
19樓2012-03-31 12:54:25
20樓2012-03-31 13:11:16
21樓2012-04-01 18:04:24
22樓2012-04-01 19:27:53
24樓2013-08-20 02:59:35
25樓2014-12-25 23:30:37
26樓2014-12-26 16:14:26
簡單回復
2012-03-04 14:52
回復
孫啟亮(金幣+1):謝謝參與
孫啟亮12樓
2012-03-06 09:32
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