 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 6594 | 回復(fù): 14 | |||
| 當前只顯示滿足指定條件的回帖，點擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
[交流]
【求助/交流】RT-PCR ，內(nèi)參在哪個步驟添加以及marker何時使用及確定？謝謝
|
|||
|
大家好， 準備做RT-PCR，看了一些資料，但是有些問題還不明； 1. 內(nèi)參一定要用，但是要何時添加，在哪個步驟添加。 看到論壇上有說單獨p，也有說和目的基因一起p，不是很清楚。 得到c DNA后PCR，這個體系要加入上游引物和下游引物，是不是內(nèi)參就作為對照，直接P？ 內(nèi)參本身是為了消除差異性，如果單獨p，是如何消除的呢？如果一起P，結(jié)果出現(xiàn)的條帶又是怎樣的呢？ 2. marker 何時用，如何選擇？ 提取出RNA后，要電泳鑒定其質(zhì)量，此時要用marker嘛？ 最終的pcr產(chǎn)物，電泳也要用到marker是嘛？那內(nèi)參怎么用的？ marker是否單獨一個孔跑還是要和目的產(chǎn)物混合來跑？ marker是根據(jù)引物的產(chǎn)物長度來確定的還是目的基因的大小確定？ 3. 別人文獻上有已知引物序列，想要使用它的序列，但是反應(yīng)條件沒有給出，自己要怎么確定條件呢？ 就是在找公司做引物的時候，需要注意些什么呢？他合成出的引物會有什么信息不？ 初學(xué)，也沒有師兄師姐帶，要直接學(xué)習(xí)，問的問題可能很幼稚，但希望高手能夠指點。 下面來說下我看到的PCR的過程： 先提取出RNA （注意不要降解），然后分裝，一部分用于電泳等檢測RNA質(zhì)量，其他4攝氏度保存，保存時間較短。 RT：按試劑盒操作。 得到的c DNA 4℃保存，保存較久。 PCR：設(shè)置反應(yīng)參數(shù)等。 這個過程有用到上游引物和下游引物，是不是內(nèi)參如參照一樣，單獨p？ 最后就是pcr產(chǎn)物的電泳測定，用到上樣緩沖體系，怎樣確定用？*的上樣緩沖體系呢？ 希望大家給小的一些指點 大恩大德 感激不盡 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有199人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
湖北師范大學(xué)招調(diào)劑啦
已經(jīng)有4人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 循環(huán)伏安法沉積鉑，沉積的鉑量怎么確定
已經(jīng)有3人回復(fù)
- pcr 帶好寬啊!苦惱，求助ing!
已經(jīng)有21人回復(fù)
- PCR時出現(xiàn)了非目的片段的超大片段條帶
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 求助，已有PDB結(jié)構(gòu)的DS同源建模步驟，謝謝
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 基因組dna檢測條帶很亮 PCR擴增后條帶非常弱 求助
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 求助：模擬過程（或者：step_2）中，添加 Tie 約束，如何添加？
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 求助：約6kb質(zhì)粒做模板的pcr程序怎么設(shè)定啊
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 發(fā)現(xiàn)了beta actin作為內(nèi)參的一個漏洞
已經(jīng)有25人回復(fù)
- 做pcr時pcr管子變形嚴重是怎么回事？
已經(jīng)有21人回復(fù)
- 菌落PCR篩選
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 【求助/交流】熒光定量PCR與半定量的RT－PCR在設(shè)計引物時有什么區(qū)別？
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 【求助/交流】做培養(yǎng)細胞的RT-PCR，β-actin內(nèi)參出現(xiàn)兩個條帶，求原因。
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【求助/交流】RTPCR 內(nèi)參
已經(jīng)有4人回復(fù)
» 搶金幣啦！回帖就可以得到:
-
五邑大學(xué)（江門-利物浦公共衛(wèi)生研究所）招收藥學(xué)、生物醫(yī)藥專業(yè)調(diào)劑生
+1/127
-
2026年贛南師范大學(xué)接收 電子信息工程+化學(xué)+材料與化工專業(yè) 調(diào)劑學(xué)生
+1/93
-
東莞理工土木工程和土木水利專業(yè)碩士接受調(diào)劑，名額充足！
+1/89
-
焊接專業(yè)應(yīng)屆畢業(yè)生招聘
+1/81
-
宜春學(xué)院 藥學(xué)研究生調(diào)劑52人
+1/53
-
接工學(xué)跨專業(yè)調(diào)劑學(xué)生，非誠勿擾，謝謝
+1/43
-
湖北師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院招收調(diào)劑
+1/41
-
上海大學(xué) “生物有機電子材料及器件”團隊碩士、博士研究生招聘
+1/34
-
濟南大學(xué)水利與環(huán)境學(xué)院趙艷俠教授簡介
+1/20
-
西南科技大學(xué)李永升老師接收材料和化工類研究生調(diào)劑
+1/18
-
汕頭大學(xué)海洋與生命學(xué)科李升康教授團隊招收生物類調(diào)劑生
+1/16
-
山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院2026年招收調(diào)劑碩士研究生
+1/15
-
煙臺大學(xué)精準材料高等研究院26年材料方向研究生招生
+1/8
-
歡迎來英國拉夫堡大學(xué)交流-結(jié)晶，蛋白質(zhì)，AI，水處理等
+1/7
-
蘇州初創(chuàng)公司誠聘化學(xué)過程工藝與硬件系統(tǒng)工程師
+1/7
-
材料與化工、環(huán)境科學(xué)專業(yè)調(diào)劑招生
+1/5
-
半導(dǎo)體光電子器件與集成
+1/3
-
環(huán)境微生物與污染控制研究所招收2026碩士研究生
+1/3
-
0854工學(xué)-電子信息考研-302分求調(diào)劑，接受跨專業(yè)，只求有學(xué)上�。�！ ! ! ! ！
+1/2
-
調(diào)劑來這邊
+1/1
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
dhd997(金幣+5): good 2011-02-16 10:41:13
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
dhd997(金幣+5): good 2011-02-16 10:41:13
|
2. marker 何時用，如何選擇？ 提取出RNA后，要電泳鑒定其質(zhì)量，此時要用marker嘛？ 最終的pcr產(chǎn)物，電泳也要用到marker是嘛？那內(nèi)參怎么用的？ marker是否單獨一個孔跑還是要和目的產(chǎn)物混合來跑？ 答：原則上講RNA檢測質(zhì)量需要用變性膠來跑才行，但大家都懶，就普通的瓊脂糖膠跑一下看看就好了，至于怎么用普通膠跑RNA檢測竅門說過很多次了，不說了。后面你又說PCR產(chǎn)物跑電泳的問題，既然用了內(nèi)參是做定量PCR為啥還跑電泳檢測啊，那這里我當你是跑普通PCR來回答問題吧，每一個PCR管跑完了之后當一個樣本，點在一個孔麗，通常講一張膠如果不是特別的多樣本的話就點一個Marker就好，用Marker已知大小的條帶來粗略判斷你的目標片段對不對。Marker的大小需要根據(jù)你目標序列的大小來購買不同的產(chǎn)品的，因為各個廠家賣的Marker大小不一樣，每種Marker還有很多個條帶 |
7樓2011-02-15 11:11:49
★
silicare(金幣+1): 謝謝參與 2011-02-12 12:21:26
amaya1545(金幣+4): 2011-02-14 12:58:43
silicare(金幣+1): 謝謝參與 2011-02-12 12:21:26
amaya1545(金幣+4): 2011-02-14 12:58:43
|
內(nèi)參基因最好和目的基因一起擴，但并不是說放在一個管里面擴，而是分開。內(nèi)參基因一定要有。如果分開擴的話，就要在兩次不同的PCR里加量化因子，消除由不同pcr反應(yīng)引起的誤差！定的引物會有信息的，特別是退火溫度，但是自己最好跑一次常規(guī)的pcr來確定。另外看了你下面的rna的問題，RNA提出出來后應(yīng)該立刻保存在-80度，而不是4度，以及cDNA也應(yīng)該是在-20度！ 祝好運 |
2樓2011-02-12 01:50:56
3樓2011-02-14 13:01:01
★ ★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
lstt09nk(金幣+3): 感謝回復(fù)，鼓勵交流 2011-02-15 10:25:21
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
lstt09nk(金幣+3): 感謝回復(fù)，鼓勵交流 2011-02-15 10:25:21
| 量化因子，你就用你的一個cdna樣品就可以的，但是必須要包含你所有的基因(內(nèi)參和目的基因)，相當于對照，每個pcr盤里面都需要，從而計算出盤與盤之間的誤差并消除他。你看看這篇文章吧，說的很清楚的：qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome biology,2007! |
4樓2011-02-15 00:07:25
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 070300化學(xué)專業(yè)279調(diào)劑 +3 | 哈哈哈^_^ 2026-03-31 | 3/150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +6 | 素年祭語 2026-03-31 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境工程297分求調(diào)劑一志愿杭高院 +4 | GENJIOW 2026-03-31 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 學(xué)碩274求調(diào)劑 +16 | Li李魚 2026-03-26 | 16/800 |
|
|
|
[考研] 機械學(xué)碩總分317求調(diào)劑！�。�！ +5 | Acaciad 2026-03-25 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 266分，求材料相關(guān)專業(yè)調(diào)劑 +10 | 哇呼哼呼哼 2026-03-30 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 本科211生物醫(yī)學(xué)工程085409求調(diào)劑339分 +5 | 里子木yy 2026-03-29 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 292求調(diào)劑 +13 | 是妍子也是研子 2026-03-30 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 286求調(diào)劑 +5 | Faune 2026-03-30 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 317分 一志愿南理工材料工程 本科湖工大 求調(diào)劑 +12 | 芋泥小鈴鐺 2026-03-28 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 284求調(diào)劑 +14 | junqihahaha 2026-03-26 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 生物技術(shù)與工程 +7 | 1294608413 2026-03-25 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 【求調(diào)劑】085601材料工程專碩 | 總分272 | +7 | 腳滑的守法公民 2026-03-27 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 070305高分子化學(xué)與物理 304分求調(diào)劑 +12 | c297914 2026-03-28 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 2026年華南師范大學(xué)歡迎化學(xué)，化工，生物，生醫(yī)工等專業(yè)優(yōu)秀學(xué)子加入！ +3 | llss0711 2026-03-28 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0856材料化工調(diào)劑 總分330 +14 | zhubinhao 2026-03-27 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 材料與化工（0856）304求B區(qū)調(diào)劑 +8 | 邱gl 2026-03-27 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 086000調(diào)劑 +3 | 7901117076 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 272求調(diào)劑 +7 | 腳滑的守法公民 2026-03-27 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿天津大學(xué)339材料與化工求調(diào)劑 +3 | 江往賣魚 2026-03-26 | 3/150 |
|