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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 請教RT-PCR 擴增問題
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請教RT-PCR 擴增問題
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用的Takara DR050s PCR擴怎程序大致為： 98℃——5min ························· 98℃——10 55℃——15s ×30循環(huán) 68℃——3min ························· · 68℃——5min 引物TM 為 66.1 和64.8 擴不出來條帶怎么優(yōu)化 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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gywyl1977
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4樓2012-05-13 12:19:30
西瓜
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【答案】應助回帖
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amisking: 回帖置頂 2012-05-13 17:34:46
amisking: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵發(fā)帖幫助解答問題。 2012-05-13 17:34:53
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你那個酶我沒用過，看了說明書，貌似是很神奇的東西。 現(xiàn)在問題是P不出來，可以采取延長退火時間，降低退火溫度，增加延伸時間，增加循環(huán)數(shù)這些通用的方法。 不過你既然是反轉錄PCR，那也有可能是cDNA模板質量不好。優(yōu)化PCR之前，最好確認下模板質量，可以用actin等內參基因來做PCR（可以用Taq等便宜的酶），假如內參都擴增不出來，那很顯然cDNA不能用。 另外，你的片段不到3kb，為毛要用這個酶啊。我看它的特長是擴增長片段，能到30kb，這是挺了不起的。相應的，價格應該很貴吧？這個很浪費啊，估計老板還不知道你這么干吧？呵呵~我建議你還是用Takara的PrimeSTAR® HS DNA Polymerase，程序用普通的就行了。 |
8樓2012-05-13 16:14:33
西瓜
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2樓2012-05-13 10:42:26
3樓2012-05-13 11:18:51
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