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請(qǐng)教RT-PCR 擴(kuò)增問(wèn)題
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用的Takara DR050s PCR擴(kuò)怎程序大致為： 98℃——5min ························· 98℃——10 55℃——15s ×30循環(huán) 68℃——3min ························· · 68℃——5min 引物TM 為 66.1 和64.8 擴(kuò)不出來(lái)?xiàng)l帶怎么優(yōu)化 |
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西瓜
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2樓2012-05-13 10:42:26
3樓2012-05-13 11:18:51
gywyl1977
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luckking: 金幣+2 2012-05-13 14:34:07
amisking: 回帖置頂 2012-05-13 17:34:40
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
luckking: 金幣+2 2012-05-13 14:34:07
amisking: 回帖置頂 2012-05-13 17:34:40
| 做RT-PCR哪有用這么長(zhǎng)的片段，擴(kuò)增效率會(huì)很低。一般也就100-200bp。這么長(zhǎng)的片斷，P出來(lái)也不能說(shuō)明問(wèn)題。還有，循環(huán)數(shù)是要摸索的，太多的話就到了PCR的平臺(tái)期，根本就看不出差別了，我們做細(xì)菌時(shí)循環(huán)數(shù)都在20個(gè)循環(huán)左右。 |
4樓2012-05-13 12:19:30
西瓜
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5樓2012-05-13 14:40:52
6樓2012-05-13 14:47:59
送鮮花一朵
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7樓2012-05-13 14:49:06
西瓜
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【答案】應(yīng)助回帖
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amisking: 回帖置頂 2012-05-13 17:34:46
amisking: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵(lì)發(fā)帖幫助解答問(wèn)題。 2012-05-13 17:34:53
amisking: 回帖置頂 2012-05-13 17:34:46
amisking: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵(lì)發(fā)帖幫助解答問(wèn)題。 2012-05-13 17:34:53
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你那個(gè)酶我沒(méi)用過(guò)，看了說(shuō)明書(shū)，貌似是很神奇的東西。 現(xiàn)在問(wèn)題是P不出來(lái)，可以采取延長(zhǎng)退火時(shí)間，降低退火溫度，增加延伸時(shí)間，增加循環(huán)數(shù)這些通用的方法。 不過(guò)你既然是反轉(zhuǎn)錄PCR，那也有可能是cDNA模板質(zhì)量不好。優(yōu)化PCR之前，最好確認(rèn)下模板質(zhì)量，可以用actin等內(nèi)參基因來(lái)做PCR（可以用Taq等便宜的酶），假如內(nèi)參都擴(kuò)增不出來(lái)，那很顯然cDNA不能用。 另外，你的片段不到3kb，為毛要用這個(gè)酶啊。我看它的特長(zhǎng)是擴(kuò)增長(zhǎng)片段，能到30kb，這是挺了不起的。相應(yīng)的，價(jià)格應(yīng)該很貴吧？這個(gè)很浪費(fèi)啊，估計(jì)老板還不知道你這么干吧？呵呵~我建議你還是用Takara的PrimeSTAR® HS DNA Polymerase，程序用普通的就行了。 |
8樓2012-05-13 16:14:33
gjs713
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