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shiliyusly新蟲 (小有名氣)
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QPCR之 擴(kuò)增效率
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大家好！之前在壇里發(fā)過帖子對于QPCR學(xué)到很多，現(xiàn)在總結(jié)就是擴(kuò)增效率很重要。 一直有2個(gè)問題基因在折磨著我，目前我還沒到絕望到換引物的地步，所以還是想先摸下優(yōu)化條件，因?yàn)槲乙镌O(shè)計(jì)也不熟練，實(shí)在是沒有把握能設(shè)計(jì)個(gè)新的好的。 一個(gè)是內(nèi)標(biāo)基因ACT，普通PCR摸的退火溫度是47度，QPCR上做了47度，60度，65度并且引物減半的，圖如下： 現(xiàn)在想請教下高手ACT接下去該怎么摸呢？ 另一個(gè)基因是F3'H,溶解曲線有個(gè)小峰，空白對照都有小峰，并且峰型和樣品的差不多，兩個(gè)峰。 之前60度二步法擴(kuò)增效率80%，后來我用52度三步法擴(kuò)增效率達(dá)到98%，線性擬合度達(dá)0.99多，想問這樣是不是OK呢，顧慮就是溶解曲線有小峰，但是空白對照就是有小峰的，空白和最低稀釋度的峰型基本一樣。有點(diǎn)奇怪。F3'H溶解曲線如下第2個(gè)圖： 還麻煩高手指點(diǎn)下啊，謝謝謝謝�。�！ 3個(gè)ACT比較圖.jpg 2Z75(V$JY09JG]IP%`PLWZE.jpg |
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2013-01-29 08:30:42
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從F3'H擴(kuò)增來看，小峰多半是引物二聚體。你說的空白對照峰型和樣品差不多是什么意思？你指空白對照也能有擴(kuò)增嗎？空白對照出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)峰的話一般是指樣品有基因組DNA污染。如果我沒記錯(cuò)，你做的是楊梅？你引物設(shè)計(jì)的時(shí)候是否跨越了內(nèi)含子？如果有跨內(nèi)含子，基因組DNA擴(kuò)增出來的峰與cDNA的峰應(yīng)該是不同的�？瞻讓φ胀菀壮霈F(xiàn)熔解溫度較低的峰，那是引物二聚體造成的，因?yàn)槿鄙偬禺悢U(kuò)增，引物二聚體形成會(huì)比樣品更嚴(yán)重一些。你的這個(gè)情況，只能說引物不好。 有一點(diǎn)要說明的是，目標(biāo)基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增時(shí)的退火溫度最好選取一致。因?yàn)樽龆繒r(shí)需要它們在同樣的條件下擴(kuò)增。為什么要這么做你大概也是知道的。熒光強(qiáng)度隨著溫度升高是衰減的，這個(gè)可以從熔解曲線上看。曲線一直是下降的，當(dāng)熔解產(chǎn)物時(shí)，有很陡的slop出現(xiàn)。所以，做很多基因定量時(shí)，引物設(shè)計(jì)方面除了要考慮特異性和高階結(jié)構(gòu)以外，還要考慮退火溫度大致相同。 從內(nèi)參的三個(gè)圖來看，內(nèi)參的引物的問題似乎更大。退火溫度高時(shí)CT數(shù)大是正常趨勢，但是圖上熔解溫度高于80°C的有兩個(gè)峰。退火溫度越低，前面的峰越大。這個(gè)說明很可能引物有非特異擴(kuò)增。如果你的內(nèi)標(biāo)出現(xiàn)這種問題，我看換引物是最佳選擇。 |
2樓2013-01-27 03:38:38
shiliyusly
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3樓2013-01-28 09:53:33
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F3'H的引物我也不知道有沒有跨內(nèi)含子，直接拿人家SCI收錄文章里的引物�？瞻椎姆搴蜆悠返姆宀畈欢�，的確是這樣有小峰的引物明顯不是很好的，但是它的擴(kuò)增效率已經(jīng)達(dá)到要求了，是不是可以用呢？另外正�？瞻讘�(yīng)該是怎么樣的呢？ ACT我還想試下用63或65度做下擴(kuò)增效率，想說這樣會(huì)不會(huì)把非特異性擴(kuò)增降到最小到?jīng)]有呢？ 這樣感覺我挺拗的，一直強(qiáng)調(diào)要換引物就是不換，主要是因?yàn)檫@樣的時(shí)間點(diǎn)怕引物快遞過來有點(diǎn)慢還有就是我對自己設(shè)計(jì)引物實(shí)在沒有信心。。。 |
4樓2013-01-28 10:05:41
cicelyzh
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正常的空白應(yīng)該沒有擴(kuò)增，什么都沒有，讀不到CT，擴(kuò)增曲線是在baseline。當(dāng)然，這是非常理想的情況，有時(shí)候是可以看到空白的擴(kuò)增曲線稍微有些抬頭的，但整個(gè)熒光水平非常低，未到達(dá)檢測限。 是否該用F3'H引物你只有自己決定了。反正不是理想的引物。對于ACT，你想摸條件也是可以的。但我覺得吧，你應(yīng)該在摸條件的同時(shí)也訂一下新的引物。 引物合成一般不是很慢吧，你對自己設(shè)計(jì)引物信心不足這個(gè)我可以理解。誰都有這個(gè)階段。尤其是做定量的引物，不是能P出來就一定好用的。一般是這樣的，反正引物也不貴，可以對一個(gè)基因設(shè)計(jì)兩三對引物，選效果好的一對做實(shí)驗(yàn)。 |
5樓2013-01-29 01:14:58
shiliyusly
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引物設(shè)計(jì)首先是確定你想要做的退火溫度，這樣大致決定多少堿基數(shù)目。然后決定你要擴(kuò)增片段的大小，一般定量不要用很大的片段，150bp-500bp。如果你已經(jīng)有不少引物了，這次合成的引物要和那些引物的差不多。然后就是引物序列了。有引物設(shè)計(jì)軟件幫助。主要是考慮引物的特異性和二級結(jié)構(gòu)問題。這個(gè)你也很明白的，特異性就是不要擴(kuò)出其他基因來。引物不要形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，引物自身及與互補(bǔ)引物之間的相連堿基配對是越少越好的。你做的是真核生物的，一般是從CDS上設(shè)計(jì)，最好能跨內(nèi)含子。實(shí)在不好辦不跨也可以。實(shí)在不行，也可以用非翻譯區(qū)的序列。考慮諸多因素后，往往是在一些引物里面挑1-2對。 這兩個(gè)公司都不錯(cuò)吧，我個(gè)人比較喜歡用bio-rad的東西。 |
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shiliyusly7樓2013-01-30 08:53:11
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