 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 4229 | 回復(fù): 8 | |||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
shiliyusly新蟲 (小有名氣)
|
[求助]
QPCR之 擴(kuò)增效率
|
||
|
大家好！之前在壇里發(fā)過帖子對于QPCR學(xué)到很多，現(xiàn)在總結(jié)就是擴(kuò)增效率很重要。 一直有2個問題基因在折磨著我，目前我還沒到絕望到換引物的地步，所以還是想先摸下優(yōu)化條件，因?yàn)槲乙镌O(shè)計(jì)也不熟練，實(shí)在是沒有把握能設(shè)計(jì)個新的好的。 一個是內(nèi)標(biāo)基因ACT，普通PCR摸的退火溫度是47度，QPCR上做了47度，60度，65度并且引物減半的，圖如下： 現(xiàn)在想請教下高手ACT接下去該怎么摸呢？ 另一個基因是F3'H,溶解曲線有個小峰，空白對照都有小峰，并且峰型和樣品的差不多，兩個峰。 之前60度二步法擴(kuò)增效率80%，后來我用52度三步法擴(kuò)增效率達(dá)到98%，線性擬合度達(dá)0.99多，想問這樣是不是OK呢，顧慮就是溶解曲線有小峰，但是空白對照就是有小峰的，空白和最低稀釋度的峰型基本一樣。有點(diǎn)奇怪。F3'H溶解曲線如下第2個圖： 還麻煩高手指點(diǎn)下啊，謝謝謝謝�。�！ 3個ACT比較圖.jpg 2Z75(V$JY09JG]IP%`PLWZE.jpg |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 QPCR 問題簡答 |
» 本帖@通知
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有182人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 相對定量中怎樣提高擴(kuò)增效率
已經(jīng)有5人回復(fù)
- real-time PCR相對定量2 -△△CT法中用來判斷擴(kuò)增效率的標(biāo)準(zhǔn)曲線怎么制作？
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 基因引物與內(nèi)參引物
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 各位做qPCR的大俠看過來～～～～～～
已經(jīng)有8人回復(fù)
- Realtime PCR 內(nèi)參與目的基因問題
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 熒光定量pcr溶解曲線好幾個峰，但是電泳只有一條目的條帶，怎么回事
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 有關(guān)RT-PCR中的一些困擾的問題
已經(jīng)有7人回復(fù)
- RT-qPCR實(shí)驗(yàn)問題
已經(jīng)有23人回復(fù)
- 著急！RT-PCR擴(kuò)增效率低，情況很詭異，求助高手幫忙指點(diǎn)
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 關(guān)于qPCR的幾個問題，求解答
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 請教RT-PCR 擴(kuò)增問題
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 一個關(guān)于qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的問題。謝謝！
已經(jīng)有12人回復(fù)
- Real-Time PCR加樣過程中的那些細(xì)節(jié)
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 熒光定量PCR擴(kuò)增效率怎么做？？？？我要被逼瘋了
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 熒光定量擴(kuò)增效率低怎么辦
已經(jīng)有3人回復(fù)
- PCR試劑進(jìn)行大批量配制分裝，卻出現(xiàn)了擴(kuò)增效率低下的結(jié)果。
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 幫我看看這個溶解qPCR曲線
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】為什么PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度比設(shè)計(jì)時的要長很多？
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【求助/交流】實(shí)時熒光定量PCR的擴(kuò)增效率低該如何改進(jìn)？
已經(jīng)有5人回復(fù)
cicelyzh
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
- MolEPI: 10
- 應(yīng)助: 1662 (講師)
- 金幣: 8693.8
- 紅花: 72
- 帖子: 3516
- 在線: 456小時
- 蟲號: 1614001
- 注冊: 2012-02-13
- 專業(yè): 生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金幣+3, 鼓勵交流 2013-01-29 08:31:00
shiliyusly: 金幣+4, ★★★很有幫助 2013-01-29 09:56:03
kx444555: 金幣+3, 鼓勵交流 2013-01-29 08:31:00
shiliyusly: 金幣+4, ★★★很有幫助 2013-01-29 09:56:03
|
正常的空白應(yīng)該沒有擴(kuò)增，什么都沒有，讀不到CT，擴(kuò)增曲線是在baseline。當(dāng)然，這是非常理想的情況，有時候是可以看到空白的擴(kuò)增曲線稍微有些抬頭的，但整個熒光水平非常低，未到達(dá)檢測限。 是否該用F3'H引物你只有自己決定了。反正不是理想的引物。對于ACT，你想摸條件也是可以的。但我覺得吧，你應(yīng)該在摸條件的同時也訂一下新的引物。 引物合成一般不是很慢吧，你對自己設(shè)計(jì)引物信心不足這個我可以理解。誰都有這個階段。尤其是做定量的引物，不是能P出來就一定好用的。一般是這樣的，反正引物也不貴，可以對一個基因設(shè)計(jì)兩三對引物，選效果好的一對做實(shí)驗(yàn)。 |
5樓2013-01-29 01:14:58
cicelyzh
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
- MolEPI: 10
- 應(yīng)助: 1662 (講師)
- 金幣: 8693.8
- 紅花: 72
- 帖子: 3516
- 在線: 456小時
- 蟲號: 1614001
- 注冊: 2012-02-13
- 專業(yè): 生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
shiliyusly: 金幣+3, ★有幫助 2013-01-28 10:05:52
kx444555: 金幣+3, 鼓勵交流 2013-01-29 08:30:42
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
shiliyusly: 金幣+3, ★有幫助 2013-01-28 10:05:52
kx444555: 金幣+3, 鼓勵交流 2013-01-29 08:30:42
|
從F3'H擴(kuò)增來看，小峰多半是引物二聚體。你說的空白對照峰型和樣品差不多是什么意思？你指空白對照也能有擴(kuò)增嗎？空白對照出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)峰的話一般是指樣品有基因組DNA污染。如果我沒記錯，你做的是楊梅？你引物設(shè)計(jì)的時候是否跨越了內(nèi)含子？如果有跨內(nèi)含子，基因組DNA擴(kuò)增出來的峰與cDNA的峰應(yīng)該是不同的�？瞻讓φ胀菀壮霈F(xiàn)熔解溫度較低的峰，那是引物二聚體造成的，因?yàn)槿鄙偬禺悢U(kuò)增，引物二聚體形成會比樣品更嚴(yán)重一些。你的這個情況，只能說引物不好。 有一點(diǎn)要說明的是，目標(biāo)基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增時的退火溫度最好選取一致。因?yàn)樽龆繒r需要它們在同樣的條件下擴(kuò)增。為什么要這么做你大概也是知道的。熒光強(qiáng)度隨著溫度升高是衰減的，這個可以從熔解曲線上看。曲線一直是下降的，當(dāng)熔解產(chǎn)物時，有很陡的slop出現(xiàn)。所以，做很多基因定量時，引物設(shè)計(jì)方面除了要考慮特異性和高階結(jié)構(gòu)以外，還要考慮退火溫度大致相同。 從內(nèi)參的三個圖來看，內(nèi)參的引物的問題似乎更大。退火溫度高時CT數(shù)大是正常趨勢，但是圖上熔解溫度高于80°C的有兩個峰。退火溫度越低，前面的峰越大。這個說明很可能引物有非特異擴(kuò)增。如果你的內(nèi)標(biāo)出現(xiàn)這種問題，我看換引物是最佳選擇。 |
2樓2013-01-27 03:38:38
shiliyusly
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 265.4
- 散金: 17
- 紅花: 1
- 帖子: 138
- 在線: 71.5小時
- 蟲號: 1434769
- 注冊: 2011-10-10
- 專業(yè): 食品科學(xué)基礎(chǔ)
3樓2013-01-28 09:53:33
shiliyusly
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 265.4
- 散金: 17
- 紅花: 1
- 帖子: 138
- 在線: 71.5小時
- 蟲號: 1434769
- 注冊: 2011-10-10
- 專業(yè): 食品科學(xué)基礎(chǔ)
|
F3'H的引物我也不知道有沒有跨內(nèi)含子，直接拿人家SCI收錄文章里的引物�？瞻椎姆搴蜆悠返姆宀畈欢�，的確是這樣有小峰的引物明顯不是很好的，但是它的擴(kuò)增效率已經(jīng)達(dá)到要求了，是不是可以用呢？另外正�？瞻讘�(yīng)該是怎么樣的呢？ ACT我還想試下用63或65度做下擴(kuò)增效率，想說這樣會不會把非特異性擴(kuò)增降到最小到?jīng)]有呢？ 這樣感覺我挺拗的，一直強(qiáng)調(diào)要換引物就是不換，主要是因?yàn)檫@樣的時間點(diǎn)怕引物快遞過來有點(diǎn)慢還有就是我對自己設(shè)計(jì)引物實(shí)在沒有信心。。。 |
4樓2013-01-28 10:05:41
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 材料與化工272求調(diào)劑 +21 | 阿斯蒂芬2004 2026-03-28 | 21/1050 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 【求調(diào)劑】085601材料工程專碩 | 總分272 | +7 | 腳滑的守法公民 2026-03-27 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 化學(xué)0703 調(diào)劑 306分 一志愿211 +7 | 26要上岸 2026-03-28 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 086000生物與醫(yī)藥調(diào)劑 +5 | Feisty。 2026-03-28 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 332求92調(diào)劑 +8 | 蕉蕉123 2026-03-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 學(xué)碩274求調(diào)劑 +9 | Li李魚 2026-03-26 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 生物學(xué)學(xué)碩，一志愿湖南大學(xué)，初試成績338 +6 | YYYYYNNNNN 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 347求調(diào)劑 +3 | 山頂見α 2026-03-25 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +7 | 墨墨漠 2026-03-27 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 315分求調(diào)劑 +7 | 26考研上岸版26 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 265求調(diào)劑 +8 | 小木蟲085600 2026-03-27 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 復(fù)試調(diào)劑，一志愿南農(nóng)083200食品科學(xué)與工程 +5 | XQTJZ 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿吉大071010，316分求調(diào)劑 +3 | xgbiknn 2026-03-27 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 286求調(diào)劑 +4 | lim0922 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 081200-11408-276學(xué)碩求調(diào)劑 +3 | 崔wj 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研]
 085602 289分求調(diào)劑
+8
|
WWW西西弗斯 2026-03-24 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 085601求調(diào)劑總分293英一數(shù)二 +4 | 鋼鐵大炮 2026-03-24 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料專碩 335 分求調(diào)劑 +4 | 拒絕冷暴力 2026-03-25 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0854AI CV方向招收調(diào)劑 +4 | 章小魚567 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 269求調(diào)劑 +4 | 我想讀研11 2026-03-23 | 4/200 |
|