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shiliyusly新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
QPCR之 擴(kuò)增效率
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大家好！之前在壇里發(fā)過(guò)帖子對(duì)于QPCR學(xué)到很多，現(xiàn)在總結(jié)就是擴(kuò)增效率很重要。 一直有2個(gè)問(wèn)題基因在折磨著我，目前我還沒(méi)到絕望到換引物的地步，所以還是想先摸下優(yōu)化條件，因?yàn)槲乙镌O(shè)計(jì)也不熟練，實(shí)在是沒(méi)有把握能設(shè)計(jì)個(gè)新的好的。 一個(gè)是內(nèi)標(biāo)基因ACT，普通PCR摸的退火溫度是47度，QPCR上做了47度，60度，65度并且引物減半的，圖如下： 現(xiàn)在想請(qǐng)教下高手ACT接下去該怎么摸呢？ 另一個(gè)基因是F3'H,溶解曲線有個(gè)小峰，空白對(duì)照都有小峰，并且峰型和樣品的差不多，兩個(gè)峰。 之前60度二步法擴(kuò)增效率80%，后來(lái)我用52度三步法擴(kuò)增效率達(dá)到98%，線性擬合度達(dá)0.99多，想問(wèn)這樣是不是OK呢，顧慮就是溶解曲線有小峰，但是空白對(duì)照就是有小峰的，空白和最低稀釋度的峰型基本一樣。有點(diǎn)奇怪。F3'H溶解曲線如下第2個(gè)圖： 還麻煩高手指點(diǎn)下啊，謝謝謝謝�。�！ 3個(gè)ACT比較圖.jpg 2Z75(V$JY09JG]IP%`PLWZE.jpg |
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 QPCR 問(wèn)題簡(jiǎn)答 |
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shiliyusly
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F3'H的引物我也不知道有沒(méi)有跨內(nèi)含子，直接拿人家SCI收錄文章里的引物。空白的峰和樣品的峰差不多，的確是這樣有小峰的引物明顯不是很好的，但是它的擴(kuò)增效率已經(jīng)達(dá)到要求了，是不是可以用呢？另外正�？瞻讘�(yīng)該是怎么樣的呢？ ACT我還想試下用63或65度做下擴(kuò)增效率，想說(shuō)這樣會(huì)不會(huì)把非特異性擴(kuò)增降到最小到?jīng)]有呢？ 這樣感覺(jué)我挺拗的，一直強(qiáng)調(diào)要換引物就是不換，主要是因?yàn)檫@樣的時(shí)間點(diǎn)怕引物快遞過(guò)來(lái)有點(diǎn)慢還有就是我對(duì)自己設(shè)計(jì)引物實(shí)在沒(méi)有信心。。。 |
4樓2013-01-28 10:05:41
cicelyzh
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從F3'H擴(kuò)增來(lái)看，小峰多半是引物二聚體。你說(shuō)的空白對(duì)照峰型和樣品差不多是什么意思？你指空白對(duì)照也能有擴(kuò)增嗎？空白對(duì)照出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)峰的話一般是指樣品有基因組DNA污染。如果我沒(méi)記錯(cuò)，你做的是楊梅？你引物設(shè)計(jì)的時(shí)候是否跨越了內(nèi)含子？如果有跨內(nèi)含子，基因組DNA擴(kuò)增出來(lái)的峰與cDNA的峰應(yīng)該是不同的。空白對(duì)照往往容易出現(xiàn)熔解溫度較低的峰，那是引物二聚體造成的，因?yàn)槿鄙偬禺悢U(kuò)增，引物二聚體形成會(huì)比樣品更嚴(yán)重一些。你的這個(gè)情況，只能說(shuō)引物不好。 有一點(diǎn)要說(shuō)明的是，目標(biāo)基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增時(shí)的退火溫度最好選取一致。因?yàn)樽龆繒r(shí)需要它們?cè)谕瑯拥臈l件下擴(kuò)增。為什么要這么做你大概也是知道的。熒光強(qiáng)度隨著溫度升高是衰減的，這個(gè)可以從熔解曲線上看。曲線一直是下降的，當(dāng)熔解產(chǎn)物時(shí)，有很陡的slop出現(xiàn)。所以，做很多基因定量時(shí)，引物設(shè)計(jì)方面除了要考慮特異性和高階結(jié)構(gòu)以外，還要考慮退火溫度大致相同。 從內(nèi)參的三個(gè)圖來(lái)看，內(nèi)參的引物的問(wèn)題似乎更大。退火溫度高時(shí)CT數(shù)大是正常趨勢(shì)，但是圖上熔解溫度高于80°C的有兩個(gè)峰。退火溫度越低，前面的峰越大。這個(gè)說(shuō)明很可能引物有非特異擴(kuò)增。如果你的內(nèi)標(biāo)出現(xiàn)這種問(wèn)題，我看換引物是最佳選擇。 |
2樓2013-01-27 03:38:38
shiliyusly
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3樓2013-01-28 09:53:33
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shiliyusly: 金幣+4, ★★★很有幫助 2013-01-29 09:56:03
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正常的空白應(yīng)該沒(méi)有擴(kuò)增，什么都沒(méi)有，讀不到CT，擴(kuò)增曲線是在baseline。當(dāng)然，這是非常理想的情況，有時(shí)候是可以看到空白的擴(kuò)增曲線稍微有些抬頭的，但整個(gè)熒光水平非常低，未到達(dá)檢測(cè)限。 是否該用F3'H引物你只有自己決定了。反正不是理想的引物。對(duì)于ACT，你想摸條件也是可以的。但我覺(jué)得吧，你應(yīng)該在摸條件的同時(shí)也訂一下新的引物。 引物合成一般不是很慢吧，你對(duì)自己設(shè)計(jì)引物信心不足這個(gè)我可以理解。誰(shuí)都有這個(gè)階段。尤其是做定量的引物，不是能P出來(lái)就一定好用的。一般是這樣的，反正引物也不貴，可以對(duì)一個(gè)基因設(shè)計(jì)兩三對(duì)引物，選效果好的一對(duì)做實(shí)驗(yàn)。 |
5樓2013-01-29 01:14:58
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