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[求助]
請(qǐng)問(wèn)qRT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線中擴(kuò)增效率過(guò)高是怎么回事 已有3人參與
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我在做4個(gè)目的基因和一個(gè)內(nèi)參基因qRT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，擴(kuò)增效率全部都超過(guò)了120%，最高的甚至達(dá)到190%。我現(xiàn)在唯一能確定的就是在加樣的過(guò)程中不同稀釋梯度（10倍的梯度）的模板cDNA在加樣過(guò)程中有相互污染，所以Ct值也不成線性的變化。我現(xiàn)在就是再重新做并嚴(yán)格避免污染，但是除了我確定的這個(gè)原因，還有其他的一些什么原因可能導(dǎo)致了擴(kuò)增效率過(guò)高呢？ 請(qǐng)有經(jīng)驗(yàn)的高手指教，非常謝謝！ 還有一個(gè)問(wèn)題，就是我的內(nèi)參基因本身的豐度比其他4個(gè)目的基因的高很多，因?yàn)榧词鼓０逑♂屃?0^5倍了，但Ct值也沒(méi)有超過(guò)20，而其他的目的基因的Ct值都在24到31之間，這種內(nèi)參基因和目的基因本身的豐度懸殊這么大，這樣的內(nèi)參可以用來(lái)作為內(nèi)參嗎？是不是找一個(gè)與目的基因相當(dāng)?shù)牟判心�？感謝解惑！ |
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5樓2014-02-26 15:28:00
atlanticwi
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2014-02-26 08:20:53
wybiology: 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-03-01 15:23:56
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... 1. 引物不合適，不僅僅有擴(kuò)增效率不夠100%的情況出現(xiàn)，同樣也有擴(kuò)增效率超過(guò)100%的情況，普通認(rèn)為90~110%的擴(kuò)增效率比較合適。你的擴(kuò)增效率過(guò)高，你需要在引物上下下工夫。 2. 這樣的內(nèi)參肯定不合適，內(nèi)參有很多，建議第一次做的時(shí)候，多上幾個(gè)內(nèi)參（3個(gè)左右）一起看看比較合適。 祝實(shí)驗(yàn)順利，說(shuō)的不周之處希望高手指點(diǎn)  |
2樓2014-02-25 20:22:54
lvbobo823
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3樓2014-02-25 20:25:58
4樓2014-02-25 22:33:54
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