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Juliana芷蕊金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
紫外分光光度法測(cè)的吸光值怎么轉(zhuǎn)化為酶反應(yīng)初速度呢？
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如題，我是用紫外光度法中的動(dòng)力學(xué)測(cè)木素過(guò)氧化物酶（Lip）的酶活， （測(cè)定方法： 取0.6 mL待測(cè)酶液，同時(shí)加入0.6 mL的10 mmol/L藜蘆醇溶液，1.8 mL的酒石酸緩沖液（pH=3.0） 250 mmol/L，用0.03 mL，40 mmol/L的H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，總體積3.0 mL，25 ℃反應(yīng)3 min，在310 nm（ε310=9300 mol-1cm-1）波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度的變化。同反應(yīng)體系做空白樣為不加入H2O2啟動(dòng)反應(yīng)。一個(gè)酶活力單位（U）定義為每分鐘氧化藜蘆醇產(chǎn)生1 μmol藜蘆醛所需的酶量。） 問(wèn)題是我測(cè)的曲線吸光度變化不大，而且各段的斜率不一，這樣在計(jì)算酶活時(shí)選線性部分我就很困惑，不知道怎么選點(diǎn)比較好，平行樣之間的平行性也不好，還有就是通過(guò)吸光度變化怎么轉(zhuǎn)化成反應(yīng)初速度呢？我做的是酶催化動(dòng)力學(xué)，做動(dòng)力學(xué)對(duì)條件要求是不是很苛刻呢？現(xiàn)在瀕臨崩潰，忠心希望各位師長(zhǎng)能給些提點(diǎn)，小妹不勝感激。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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Juliana芷蕊(金幣+44): 2011-06-17 22:42:22
amisking(金幣-43): 樓主操作失誤，申請(qǐng)取回多余金幣。 2011-06-18 18:54:54
Juliana芷蕊(金幣+44): 2011-06-17 22:42:22
amisking(金幣-43): 樓主操作失誤，申請(qǐng)取回多余金幣。 2011-06-18 18:54:54
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...俺說(shuō)的就是怎么求啊~~~什么酶求都是類(lèi)似的~主要就是從定義出發(fā)就可以了~書(shū)的話得弄本生物化學(xué)習(xí)題？呵呵~找找有沒(méi)有酶活計(jì)算的~ |
4樓2011-06-17 16:41:51
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
wolfebst(金幣+5, EPI+1): 鼓勵(lì)一下 2011-06-16 23:13:45
Juliana芷蕊(金幣+3): 我主要想問(wèn)的是紫外分光光度法測(cè)的吸光值怎么轉(zhuǎn)化為酶（Lip）反應(yīng)初速度，主要想知道轉(zhuǎn)化公式呢，還是謝謝你呢 2011-06-17 08:49:35
wolfebst(金幣+5, EPI+1): 鼓勵(lì)一下 2011-06-16 23:13:45
Juliana芷蕊(金幣+3): 我主要想問(wèn)的是紫外分光光度法測(cè)的吸光值怎么轉(zhuǎn)化為酶（Lip）反應(yīng)初速度，主要想知道轉(zhuǎn)化公式呢，還是謝謝你呢 2011-06-17 08:49:35
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你得先確認(rèn)你的酶有沒(méi)有活性 如果有活性的話，理論上是可以測(cè)定酶活的 1.動(dòng)力學(xué)的測(cè)量數(shù)據(jù)好壞取決于你的底物濃度和酶的濃度，酶多了反應(yīng)太快來(lái)不及檢測(cè)。應(yīng)該將酶液稀釋?zhuān)鞍琢靠梢杂肂RADFORD法測(cè)定，就我感覺(jué)600微升的酶液量挺大的了~ 2.測(cè)量的線性范圍至少應(yīng)該是2min,結(jié)果才會(huì)比較可信。取得時(shí)候都是取初始的一段時(shí)間，要保證反應(yīng)速率恒定 |
2樓2011-06-16 23:01:05
【答案】應(yīng)助回帖
Juliana芷蕊(金幣+3): 我主要是想將用紫外測(cè)的吸光度變化轉(zhuǎn)化成酶反應(yīng)初速度呢？前輩知道這方面的書(shū)籍嗎？給推薦一下吧，不勝感激呢！有轉(zhuǎn)化公式更好了，我做的是Lip酶呢 2011-06-17 16:33:43
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....這個(gè)問(wèn)題很多書(shū)上都有的，基本來(lái)說(shuō)，都是根據(jù)朗伯-比爾定律來(lái)計(jì)算的 I=εbc 其中I是吸光度，εbc 分別是：物質(zhì)的吸光系數(shù)，光程，物質(zhì)的量濃度，根據(jù)公式算出物質(zhì)的量濃度變化，乘以反應(yīng)體積，就是反應(yīng)的物質(zhì)的量，處于體系中的蛋白量，得到比酶活，做不同底物濃度下的比酶活，取雙倒數(shù)，應(yīng)該是接近線性的~再利用米氏方程的倒數(shù)形式求的Km就可以了 |
3樓2011-06-17 09:02:41
Juliana芷蕊
金蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 2254.7
- 散金: 217
- 沙發(fā): 1
- 帖子: 226
- 在線: 46.1小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1121851
- 注冊(cè): 2010-10-13
- 性別: MM
- 專(zhuān)業(yè): 環(huán)境工程
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前輩們，我是只困惑的蟲(chóng)子，我也要算酶活，進(jìn)而計(jì)算反應(yīng)初速度，麻煩幫我下呢 我是用紫外分光光度計(jì)中的動(dòng)力學(xué)測(cè)得木素過(guò)氧化物酶（Lip）酶在反應(yīng)3min內(nèi)的吸光度變化，變化大概有0.3左右，現(xiàn)在我很困惑，不知道怎么把吸光度變化轉(zhuǎn)化成酶催化反應(yīng)初速度呢。我測(cè)的過(guò)程：1cm比色皿中加 808ul 500mmol/l AOT/異辛烷儲(chǔ)備液，1642ul異辛烷，30mmol/l溶在甲苯中的VA儲(chǔ)備液+甲苯=250ul,60ul PH=3.6 的檸檬酸緩沖液，混合液振蕩直至透明澄清。然后加入20ulLip酶液，輕輕混勻，20min后加入100ul溶在甲苯中的飽和H2O2溶液。于310nm處反應(yīng)啟動(dòng)后立即記錄吸光度A，吸光度A對(duì)反應(yīng)時(shí)間t作圖，初速度（umol•L-1•min-1）為A-t曲線線性部分的斜率。定義每分鐘使1μmol的藜蘆醇氧化成藜蘆醛所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)，藜蘆醛的摩爾吸光系數(shù)9 300 mol-1cm-1。 我發(fā)了求助帖《紫外分光光度法測(cè)的吸光值怎么轉(zhuǎn)化為酶反應(yīng)初速度呢？》 麻煩前輩指點(diǎn)一二呢！謝謝呢…… |
5樓2011-06-17 19:31:52
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