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Juliana芷蕊金蟲 (小有名氣)
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[求助]
紫外分光光度法測的吸光值怎么轉(zhuǎn)化為酶反應(yīng)初速度呢？
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如題，我是用紫外光度法中的動力學(xué)測木素過氧化物酶（Lip）的酶活， （測定方法： 取0.6 mL待測酶液，同時加入0.6 mL的10 mmol/L藜蘆醇溶液，1.8 mL的酒石酸緩沖液（pH=3.0） 250 mmol/L，用0.03 mL，40 mmol/L的H2O2啟動反應(yīng)，總體積3.0 mL，25 ℃反應(yīng)3 min，在310 nm（ε310=9300 mol-1cm-1）波長下測定吸光度的變化。同反應(yīng)體系做空白樣為不加入H2O2啟動反應(yīng)。一個酶活力單位（U）定義為每分鐘氧化藜蘆醇產(chǎn)生1 μmol藜蘆醛所需的酶量。） 問題是我測的曲線吸光度變化不大，而且各段的斜率不一，這樣在計算酶活時選線性部分我就很困惑，不知道怎么選點比較好，平行樣之間的平行性也不好，還有就是通過吸光度變化怎么轉(zhuǎn)化成反應(yīng)初速度呢？我做的是酶催化動力學(xué)，做動力學(xué)對條件要求是不是很苛刻呢？現(xiàn)在瀕臨崩潰，忠心希望各位師長能給些提點，小妹不勝感激。 |
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10樓2012-11-28 21:47:42
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
wolfebst(金幣+5, EPI+1): 鼓勵一下 2011-06-16 23:13:45
Juliana芷蕊(金幣+3): 我主要想問的是紫外分光光度法測的吸光值怎么轉(zhuǎn)化為酶（Lip）反應(yīng)初速度，主要想知道轉(zhuǎn)化公式呢，還是謝謝你呢 2011-06-17 08:49:35
wolfebst(金幣+5, EPI+1): 鼓勵一下 2011-06-16 23:13:45
Juliana芷蕊(金幣+3): 我主要想問的是紫外分光光度法測的吸光值怎么轉(zhuǎn)化為酶（Lip）反應(yīng)初速度，主要想知道轉(zhuǎn)化公式呢，還是謝謝你呢 2011-06-17 08:49:35
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你得先確認你的酶有沒有活性 如果有活性的話，理論上是可以測定酶活的 1.動力學(xué)的測量數(shù)據(jù)好壞取決于你的底物濃度和酶的濃度，酶多了反應(yīng)太快來不及檢測。應(yīng)該將酶液稀釋，蛋白量可以用BRADFORD法測定，就我感覺600微升的酶液量挺大的了~ 2.測量的線性范圍至少應(yīng)該是2min,結(jié)果才會比較可信。取得時候都是取初始的一段時間，要保證反應(yīng)速率恒定 |
2樓2011-06-16 23:01:05
【答案】應(yīng)助回帖
Juliana芷蕊(金幣+3): 我主要是想將用紫外測的吸光度變化轉(zhuǎn)化成酶反應(yīng)初速度呢？前輩知道這方面的書籍嗎？給推薦一下吧，不勝感激呢！有轉(zhuǎn)化公式更好了，我做的是Lip酶呢 2011-06-17 16:33:43
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....這個問題很多書上都有的，基本來說，都是根據(jù)朗伯-比爾定律來計算的 I=εbc 其中I是吸光度，εbc 分別是：物質(zhì)的吸光系數(shù)，光程，物質(zhì)的量濃度，根據(jù)公式算出物質(zhì)的量濃度變化，乘以反應(yīng)體積，就是反應(yīng)的物質(zhì)的量，處于體系中的蛋白量，得到比酶活，做不同底物濃度下的比酶活，取雙倒數(shù)，應(yīng)該是接近線性的~再利用米氏方程的倒數(shù)形式求的Km就可以了 |
3樓2011-06-17 09:02:41
4樓2011-06-17 16:41:51
Juliana芷蕊
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前輩們，我是只困惑的蟲子，我也要算酶活，進而計算反應(yīng)初速度，麻煩幫我下呢 我是用紫外分光光度計中的動力學(xué)測得木素過氧化物酶（Lip）酶在反應(yīng)3min內(nèi)的吸光度變化，變化大概有0.3左右，現(xiàn)在我很困惑，不知道怎么把吸光度變化轉(zhuǎn)化成酶催化反應(yīng)初速度呢。我測的過程：1cm比色皿中加 808ul 500mmol/l AOT/異辛烷儲備液，1642ul異辛烷，30mmol/l溶在甲苯中的VA儲備液+甲苯=250ul,60ul PH=3.6 的檸檬酸緩沖液，混合液振蕩直至透明澄清。然后加入20ulLip酶液，輕輕混勻，20min后加入100ul溶在甲苯中的飽和H2O2溶液。于310nm處反應(yīng)啟動后立即記錄吸光度A，吸光度A對反應(yīng)時間t作圖，初速度（umol•L-1•min-1）為A-t曲線線性部分的斜率。定義每分鐘使1μmol的藜蘆醇氧化成藜蘆醛所需的酶量為一個酶活力單位(U)，藜蘆醛的摩爾吸光系數(shù)9 300 mol-1cm-1。 我發(fā)了求助帖《紫外分光光度法測的吸光值怎么轉(zhuǎn)化為酶反應(yīng)初速度呢？》 麻煩前輩指點一二呢！謝謝呢…… |
5樓2011-06-17 19:31:52
Juliana芷蕊
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，定當重謝呢，
6樓2011-06-17 19:34:54
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還在困惑中！ 7樓2011-06-22 17:58:49
Juliana芷蕊
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8樓2011-06-23 09:03:19
zhang8826857: 編輯內(nèi)容 2012-08-10 16:41
 [ Last edited by zhang8826857 on 2012-8-10 at 16:41 ] |
9樓2012-08-10 16:36:30
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