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Juliana芷蕊金蟲 (小有名氣)
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[求助]
紫外分光光度法測的吸光值怎么轉(zhuǎn)化為酶反應初速度呢？
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如題，我是用紫外光度法中的動力學測木素過氧化物酶（Lip）的酶活， （測定方法： 取0.6 mL待測酶液，同時加入0.6 mL的10 mmol/L藜蘆醇溶液，1.8 mL的酒石酸緩沖液（pH=3.0） 250 mmol/L，用0.03 mL，40 mmol/L的H2O2啟動反應，總體積3.0 mL，25 ℃反應3 min，在310 nm（ε310=9300 mol-1cm-1）波長下測定吸光度的變化。同反應體系做空白樣為不加入H2O2啟動反應。一個酶活力單位（U）定義為每分鐘氧化藜蘆醇產(chǎn)生1 μmol藜蘆醛所需的酶量。） 問題是我測的曲線吸光度變化不大，而且各段的斜率不一，這樣在計算酶活時選線性部分我就很困惑，不知道怎么選點比較好，平行樣之間的平行性也不好，還有就是通過吸光度變化怎么轉(zhuǎn)化成反應初速度呢？我做的是酶催化動力學，做動力學對條件要求是不是很苛刻呢？現(xiàn)在瀕臨崩潰，忠心希望各位師長能給些提點，小妹不勝感激。 |
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swqowen
金蟲 (職業(yè)作家)
勛章歸天
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還在困惑中！ 
7樓2011-06-22 17:58:49
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★
wolfebst(金幣+5, EPI+1): 鼓勵一下 2011-06-16 23:13:45
Juliana芷蕊(金幣+3): 我主要想問的是紫外分光光度法測的吸光值怎么轉(zhuǎn)化為酶（Lip）反應初速度，主要想知道轉(zhuǎn)化公式呢，還是謝謝你呢 2011-06-17 08:49:35
wolfebst(金幣+5, EPI+1): 鼓勵一下 2011-06-16 23:13:45
Juliana芷蕊(金幣+3): 我主要想問的是紫外分光光度法測的吸光值怎么轉(zhuǎn)化為酶（Lip）反應初速度，主要想知道轉(zhuǎn)化公式呢，還是謝謝你呢 2011-06-17 08:49:35
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你得先確認你的酶有沒有活性 如果有活性的話，理論上是可以測定酶活的 1.動力學的測量數(shù)據(jù)好壞取決于你的底物濃度和酶的濃度，酶多了反應太快來不及檢測。應該將酶液稀釋，蛋白量可以用BRADFORD法測定，就我感覺600微升的酶液量挺大的了~ 2.測量的線性范圍至少應該是2min,結(jié)果才會比較可信。取得時候都是取初始的一段時間，要保證反應速率恒定 |
2樓2011-06-16 23:01:05
【答案】應助回帖
Juliana芷蕊(金幣+3): 我主要是想將用紫外測的吸光度變化轉(zhuǎn)化成酶反應初速度呢？前輩知道這方面的書籍嗎？給推薦一下吧，不勝感激呢！有轉(zhuǎn)化公式更好了，我做的是Lip酶呢 2011-06-17 16:33:43
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....這個問題很多書上都有的，基本來說，都是根據(jù)朗伯-比爾定律來計算的 I=εbc 其中I是吸光度，εbc 分別是：物質(zhì)的吸光系數(shù)，光程，物質(zhì)的量濃度，根據(jù)公式算出物質(zhì)的量濃度變化，乘以反應體積，就是反應的物質(zhì)的量，處于體系中的蛋白量，得到比酶活，做不同底物濃度下的比酶活，取雙倒數(shù)，應該是接近線性的~再利用米氏方程的倒數(shù)形式求的Km就可以了 |
3樓2011-06-17 09:02:41
4樓2011-06-17 16:41:51
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