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aloon111金蟲 (正式寫手)
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[求助]
如何用熔點法測定G+C mol%含量？
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如何用熔點法測定G+C mol%含量？所用的DNA是總DNA還是16s rDNA? 每一溫度處理多少時間？用普通的紫外可見分光光度計沒可以嗎？ 測OD值時，溫度下降會不會造成DNA復性影響測量結果？ 有沒有具體的操作步驟？ 謝謝。 |
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duckula7708
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2樓2011-06-23 01:50:14
aloon111
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3樓2011-06-23 09:05:23
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【答案】應助回帖
aloon111(金幣+2): 謝謝了 2011-06-29 17:34:28
aloon111(金幣+2): 2011-06-30 15:53:45
aloon111(金幣+2): 2011-06-30 15:53:45
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熔點法應該就是熱變性溫度測定法(Tm法)吧。 1. 所用DNA是基因組DNA，且無RNA污染，用紫外分光光度法測定純度，天然DNA在260、230、280nm處的比值為：OD230:260:280=0.454:1:0.515，并結合瓊脂糖凝膠電泳檢測。DNA含量測定使用紫外分光光度法。 2.按照每分鐘升溫1℃的速度設置升溫程序即可。 3.普通的紫外分光光度計沒有加熱系統(tǒng)測不了，現(xiàn)在有專門測G+Cmol%的儀器，比普通的紫外分光光度計多了加熱系統(tǒng)和溫度記錄系統(tǒng)，可以設置升溫程序。 4.測OD值時，溫度下降，如果是在低溫還沒有開始解鏈的過程，是不會造成DNA復性的；如果已經(jīng)開始解鏈，溫度下降肯定會造成DNA復性，肯定會影響測量結果。 5.具體步驟（這《微生物學實驗技術》上的，可行）： （1）DNA提取 參照地衣芽胞桿菌染色體DNA提取方法，提取普通變形桿菌和E.coli K-12的DNA，并分別用0.1×SSC溶液溶解并稀釋，使測定用DNA的最終濃度為A260nm=0.15~0.30，純度為A260：A280：A230≥1：0.515：0.450。 （2）將帶測菌株普通變形桿菌DNA的參比菌株E.coli K-12的DNA分別裝入兩只石英比色杯中，塞好帶有晶體管點溫度計熱敏電阻探頭的塞子，另一帶塞子的石英比色杯裝入0.1×SSC作空白對照。 （3）比色杯放入分光光度計的帶有加熱裝置的比色架內，固定波長在260nm。 （4）迅速將比色杯內的溫度上升到50℃左右，取出比色杯檢查有無氣泡，如有氣泡用手指輕彈除去。 （5）設置測定程序 按照每分鐘升溫1℃的速度設置升溫程序，具體的設置方法按儀器使用說明進行。 （6）測定終點判斷 從50℃開始繼續(xù)加熱，同時記錄變性曲線，當溫度增加到A260吸收不再增加時即為測定終點。 （7）GC含量計算 在0.1×SSC溶液中，G+C mol%的計算公式為： G+C mol%=51.2+2.08×（Tm（X）- Tm（R）） 其中Tm（X）為待測菌Tm值，Tm（R）為E.coli K-12的的Tm值 |
4樓2011-06-23 11:08:17
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