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aloon111金蟲 (正式寫手)
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[求助]
如何用熔點(diǎn)法測(cè)定G+C mol%含量？
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如何用熔點(diǎn)法測(cè)定G+C mol%含量？所用的DNA是總DNA還是16s rDNA? 每一溫度處理多少時(shí)間？用普通的紫外可見分光光度計(jì)沒可以嗎？ 測(cè)OD值時(shí)，溫度下降會(huì)不會(huì)造成DNA復(fù)性影響測(cè)量結(jié)果？ 有沒有具體的操作步驟？ 謝謝。 |
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802311820
金蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
aloon111(金幣+2): 謝謝了 2011-06-29 17:34:28
aloon111(金幣+2): 2011-06-30 15:53:45
aloon111(金幣+2): 2011-06-30 15:53:45
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熔點(diǎn)法應(yīng)該就是熱變性溫度測(cè)定法(Tm法)吧。 1. 所用DNA是基因組DNA，且無(wú)RNA污染，用紫外分光光度法測(cè)定純度，天然DNA在260、230、280nm處的比值為：OD230:260:280=0.454:1:0.515，并結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。DNA含量測(cè)定使用紫外分光光度法。 2.按照每分鐘升溫1℃的速度設(shè)置升溫程序即可。 3.普通的紫外分光光度計(jì)沒有加熱系統(tǒng)測(cè)不了，現(xiàn)在有專門測(cè)G+Cmol%的儀器，比普通的紫外分光光度計(jì)多了加熱系統(tǒng)和溫度記錄系統(tǒng)，可以設(shè)置升溫程序。 4.測(cè)OD值時(shí)，溫度下降，如果是在低溫還沒有開始解鏈的過(guò)程，是不會(huì)造成DNA復(fù)性的；如果已經(jīng)開始解鏈，溫度下降肯定會(huì)造成DNA復(fù)性，肯定會(huì)影響測(cè)量結(jié)果。 5.具體步驟（這《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》上的，可行）： （1）DNA提取 參照地衣芽胞桿菌染色體DNA提取方法，提取普通變形桿菌和E.coli K-12的DNA，并分別用0.1×SSC溶液溶解并稀釋，使測(cè)定用DNA的最終濃度為A260nm=0.15~0.30，純度為A260：A280：A230≥1：0.515：0.450。 （2）將帶測(cè)菌株普通變形桿菌DNA的參比菌株E.coli K-12的DNA分別裝入兩只石英比色杯中，塞好帶有晶體管點(diǎn)溫度計(jì)熱敏電阻探頭的塞子，另一帶塞子的石英比色杯裝入0.1×SSC作空白對(duì)照。 （3）比色杯放入分光光度計(jì)的帶有加熱裝置的比色架內(nèi)，固定波長(zhǎng)在260nm。 （4）迅速將比色杯內(nèi)的溫度上升到50℃左右，取出比色杯檢查有無(wú)氣泡，如有氣泡用手指輕彈除去。 （5）設(shè)置測(cè)定程序 按照每分鐘升溫1℃的速度設(shè)置升溫程序，具體的設(shè)置方法按儀器使用說(shuō)明進(jìn)行。 （6）測(cè)定終點(diǎn)判斷 從50℃開始繼續(xù)加熱，同時(shí)記錄變性曲線，當(dāng)溫度增加到A260吸收不再增加時(shí)即為測(cè)定終點(diǎn)。 （7）GC含量計(jì)算 在0.1×SSC溶液中，G+C mol%的計(jì)算公式為： G+C mol%=51.2+2.08×（Tm（X）- Tm（R）） 其中Tm（X）為待測(cè)菌Tm值，Tm（R）為E.coli K-12的的Tm值 |
4樓2011-06-23 11:08:17
duckula7708
木蟲 (正式寫手)
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2樓2011-06-23 01:50:14
aloon111
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3樓2011-06-23 09:05:23
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