 |
 |
 |
| 24小時(shí)熱門版塊排行榜 |
- >論壇更新日志 (5004)
- >考研 (2052)
- >導(dǎo)師招生 (1870)
- >文獻(xiàn)求助 (345)
- >蟲(chóng)友互識(shí) (317)
- >碩博家園 (165)
- >考博 (138)
- >招聘信息布告欄 (108)
- >博后之家 (89)
- >休閑灌水 (71)
- >論文投稿 (62)
- >基金申請(qǐng) (45)
- >綠色求助(高懸賞) (42)
- >找工作 (40)
- >外文書(shū)籍求助 (23)
- >教師之家 (23)
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 7 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2010 | 回復(fù): 6 | |||
| 本帖產(chǎn)生 1 個(gè) MolEPI ，點(diǎn)擊這里進(jìn)行查看 | |||
jeavy2008
|
[求助]
未知基因片段的釣取討論，懇請(qǐng)大家?guī)臀曳治龇治?
|
||
|
本人釣取的是高原鼠兔HMG-CoA還原酶（膽固醇合成關(guān)鍵酶）的cDNA序列，已經(jīng)做了3,4個(gè)月了，一直毫無(wú)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)流程如下：采樣----提RNA----逆轉(zhuǎn)錄-----PCR。 一，采樣。 采樣地區(qū)實(shí)驗(yàn)條件受限制，只有-20度的冰箱，因此沒(méi)辦法只好取完肝臟剪碎放入RNA保護(hù)液里，然后再放入-20度冰箱。所有樣品采完后用冰盒運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，中間大概有2天不到的時(shí)間，回來(lái)后全部解凍了，冰盒估計(jì)10幾度的樣子。不過(guò)這樣本人感覺(jué)RNA應(yīng)該不會(huì)降解很嚴(yán)重，RNA保護(hù)液上說(shuō)-20度可以保持3個(gè)月，25度保存1-2周，試劑為國(guó)產(chǎn)試劑，再差應(yīng)該不可能全部降解。 二，RNA提取 買的提取液提取的，所有操作與要用的試劑儀器等都有過(guò)用DEPC處理，先是買的索萊寶的（國(guó)產(chǎn)試劑，質(zhì)量差，老板省錢要找便宜的買），沒(méi)出條帶。后來(lái)買的上海生工的，依然沒(méi)出條帶。最后買了百泰克的RNA組織提取液才提出來(lái)，OD260/280 1.8-1.99。條帶不是很清楚，但是可以清楚看到有兩條帶，但是18:28沒(méi)有1:2，大多情況下只有1:1，有時(shí)候還2:1.圖片見(jiàn)于附件，有幾張比較好的沒(méi)傳上去。 三，逆轉(zhuǎn)錄 這一步是用試劑盒的，用的百泰克的cDNA一步法合成的。合成的總體系是20ul，沒(méi)有稀釋直接做模板，為了驗(yàn)證cDNA合成是否成功，本人跑過(guò)膠，也跑過(guò)內(nèi)參。膠呈smear，內(nèi)參有條帶，都是很亮的。這證明cDNA這步應(yīng)該沒(méi)啥問(wèn)題。 四，PCR 這一步就是最關(guān)鍵了，本人設(shè)計(jì)了4對(duì)引物，1對(duì)從文獻(xiàn)上找的，人家是做小鼠的。兩對(duì)是在cDNA的 CDS序列兩端設(shè)計(jì)的，取的相對(duì)保守的區(qū)域設(shè)計(jì)的（這兩對(duì)剛學(xué)會(huì)設(shè)計(jì)引物時(shí)設(shè)計(jì)的，估計(jì)PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)而且引物也不太好，PCR產(chǎn)物2600BP），條帶沒(méi)出。后來(lái)我比對(duì)了幾種動(dòng)物的cDNA序列，大小鼠，人，兔子，黑猩猩，金黃地鼠。找到他們的cDNA相同的地方，用PP5.0設(shè)計(jì)了一對(duì)分?jǐn)?shù)93分的引物，3‘端取的是嚴(yán)格保守區(qū)，就是幾種動(dòng)物一致的地方，5’端有1到兩個(gè)堿基不是最保守的，產(chǎn)物1000BP多點(diǎn)，Tm一個(gè)52度，一個(gè)54度，從45到55進(jìn)行梯度PCR也沒(méi)出條帶。這三對(duì)引物試了近半個(gè)月，換了幾十次模板和條件都一直沒(méi)出結(jié)果。最后一對(duì)是文獻(xiàn)上的，有目的條帶，條帶比較暗，PCR產(chǎn)物送去測(cè)序沒(méi)成功說(shuō)濃度不夠，后來(lái)沒(méi)辦法就做了下TA克隆，測(cè)序回來(lái)是假陽(yáng)性(附件中菌液測(cè)序是雙向測(cè)序沒(méi)拼接的，其他兩個(gè)是用菌液做的PCR出的產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果)，都不是我的那種酶的基因。最杯具的發(fā)生了，偶然做了下空白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白也有條帶，而且和第四對(duì)引物的位置一樣，剛開(kāi)始以為是污染，就所有試劑什么的全換了，結(jié)果空白還是有條帶，而且跟目的條帶一個(gè)位置。最后懷疑是不是百泰克的酶有問(wèn)題，換了TAKARA的RTAQ酶，這下一跑PCR，第四對(duì)引物也沒(méi)有條帶，自此證明第四條引物為假陽(yáng)性，擴(kuò)增的是TAG酶里面的大腸桿菌基因組的一個(gè)片段，和我目的片段非常相似，460BP左右。沒(méi)辦法，只有從新設(shè)計(jì)引物�，F(xiàn)在引物正在合成中。 本人大概的實(shí)驗(yàn)流程就這樣了，附件附有所有的實(shí)驗(yàn)圖與引物和在NCBI里查的cDNA序列。懇請(qǐng)哪位高人幫我看看到底是哪出問(wèn)題了？再懇請(qǐng)大家是否能依照附件的序列幫我設(shè)計(jì)一些好的引物，或者是簡(jiǎn)并引物。 謝謝大家！祝大家實(shí)驗(yàn)成功，天天開(kāi)心。 附件下載地址：http://www.rayfile.com/files/5e6 ... -b91c-0015c55db73d/ |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有196人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
湖北師范大學(xué)招調(diào)劑啦
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
邵陽(yáng)學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- DNA電泳圖，奇怪的條帶，大家?guī)臀医饨饣蠓治鱿掳?/a>
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 請(qǐng)大家?guī)臀铱磦�(gè)紅外分析，可能有哪些基團(tuán)
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 質(zhì)粒DNA提取成了這樣，請(qǐng)大家?guī)兔Ψ治鲆幌?/a>
已經(jīng)有27人回復(fù)
- 急！急！求助！請(qǐng)大家?guī)臀曳治鱿聻槭裁磧H僅進(jìn)樣體積不一樣，峰形就變了呢？！
已經(jīng)有22人回復(fù)
- 環(huán)科院環(huán)境檢測(cè)還是藥物所藥物分析？？大家?guī)蛶臀襼
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助】求大家?guī)臀曳治鲆幌逻@張ESI質(zhì)譜圖
已經(jīng)有34人回復(fù)
- 北京和深圳，哪個(gè)好呢？請(qǐng)大家?guī)臀曳治鱿?/a>
已經(jīng)有28人回復(fù)
- 【求助/交流】舉例說(shuō)明模式生物中一個(gè)基因的序列的獲取、序列分析和功能分析
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 【求助】希望大家?guī)臀曳治鱿略?/a>
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【求助/交流】如何確定未知基因編碼氨基酸～
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 【交流】想考北京的分析化學(xué)或藥物分析方面的博士研究生，請(qǐng)大家?guī)臀彝扑]幾個(gè)地方吧
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 【求助/交流】急求大家?guī)臀曳治鲆幌挛业幕蚪MDNA電泳圖
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 【求助/交流】RNA的提取問(wèn)題和qRT-PCR分析基因在不同時(shí)間的定量表達(dá)
已經(jīng)有10人回復(fù)
Arrennew
鐵桿木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- MolEPI: 4
- 應(yīng)助: 19 (小學(xué)生)
- 金幣: 7777.5
- 紅花: 2
- 帖子: 301
- 在線: 122.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 322853
- 注冊(cè): 2007-03-12
- 性別: GG
- 專業(yè): 林木遺傳育種學(xué)
2樓2011-07-04 22:05:17
gwbk
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- MolEPI: 54
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 2293.5
- 紅花: 24
- 帖子: 529
- 在線: 186.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1320681
- 注冊(cè): 2011-06-11
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
西瓜(金幣+3): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-05 00:44:55
jeavy2008(金幣+1): 2011-07-05 13:04:32
西瓜(金幣+3): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-05 00:44:55
jeavy2008(金幣+1): 2011-07-05 13:04:32
|
看了樓主的引物資料，發(fā)現(xiàn)引物是以大鼠和小鼠為模板進(jìn)行設(shè)計(jì)的。 但是高原鼠兔和兔子是近親，和大鼠小鼠親緣關(guān)系？為什么不多參考兔子DNA或者CDS序列為模板進(jìn)行引物設(shè)計(jì)呢？ 有目的條帶的那一組直接溶液回收做模板，做一個(gè)二次PCR看看亮不亮。 做Touchdown也是不錯(cuò)的選擇，Touchdown和梯度各有優(yōu)點(diǎn)，可是嘗試一下。 |
3樓2011-07-04 23:02:47
jeavy2008 
捐助貴賓 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 3697.6
- 散金: 125
- 紅花: 1
- 帖子: 134
- 在線: 19.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1330178
- 注冊(cè): 2011-06-24
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
4樓2011-07-05 12:55:16
jeavy2008
捐助貴賓 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 3697.6
- 散金: 125
- 紅花: 1
- 帖子: 134
- 在線: 19.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1330178
- 注冊(cè): 2011-06-24
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
5樓2011-07-05 13:03:51
jeavy2008
捐助貴賓 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 3697.6
- 散金: 125
- 紅花: 1
- 帖子: 134
- 在線: 19.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1330178
- 注冊(cè): 2011-06-24
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
6樓2011-07-06 10:33:52
lingonghua
鐵桿木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 7 (幼兒園)
- 金幣: 4980
- 散金: 219
- 紅花: 3
- 帖子: 738
- 在線: 466.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 335478
- 注冊(cè): 2007-03-31
- 性別: GG
- 專業(yè): 分子與進(jìn)化生態(tài)學(xué)
7樓2011-08-06 17:09:49
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 jeavy2008 的主題更新
| 7 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +3 | Eujd1 2026-03-31 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 271求調(diào)劑 +4 | 勒布朗@ 2026-03-31 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境工程297分求調(diào)劑一志愿杭高院 +5 | GENJIOW 2026-03-31 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 315求調(diào)劑 +5 | akie... 2026-03-28 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0856調(diào)劑 +6 | 曲聽(tīng)筠 2026-03-30 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿西交288化工專碩求調(diào)劑 +4 | 好運(yùn)好運(yùn)接接 2026-03-24 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料與化工調(diào)劑一志愿大連海事085600，349 +6 | 吃的不少 2026-03-30 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 332求調(diào)劑 +14 | 032500 2026-03-25 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 26考研-291分-廈門大學(xué)（085601）-柔性電子學(xué)院材料工程專業(yè)求調(diào)劑 +5 | min3 2026-03-24 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 考研調(diào)劑 +5 | Sanmu-124 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[基金申請(qǐng)] 面上5B能上會(huì)嗎？ +7 | redcom 2026-03-29 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 348求調(diào)劑 +6 | 小懶蟲(chóng)不懶了 2026-03-28 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 337求調(diào)劑 +6 | 《樹(shù)》 2026-03-29 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿南昌大學(xué)324求調(diào)劑 +5 | hanamiko 2026-03-29 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 343求調(diào)劑 +6 | 愛(ài)羈絆 2026-03-29 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 356求調(diào)劑 +4 | gysy?s?a 2026-03-28 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 085600，材料與化工321分，求調(diào)劑 +9 | 大饞小子 2026-03-27 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 一志愿鄭大085600，310分求調(diào)劑 +5 | 李瀟可 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 081200-11408-276學(xué)碩求調(diào)劑 +4 | 崔wj 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料專碩 335 分求調(diào)劑 +4 | 拒絕冷暴力 2026-03-25 | 4/200 |
|