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jeavy2008
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[求助]
未知基因片段的釣取討論，懇請(qǐng)大家?guī)臀曳治龇治?
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本人釣取的是高原鼠兔HMG-CoA還原酶（膽固醇合成關(guān)鍵酶）的cDNA序列，已經(jīng)做了3,4個(gè)月了，一直毫無結(jié)果。實(shí)驗(yàn)流程如下：采樣----提RNA----逆轉(zhuǎn)錄-----PCR。 一，采樣。 采樣地區(qū)實(shí)驗(yàn)條件受限制，只有-20度的冰箱，因此沒辦法只好取完肝臟剪碎放入RNA保護(hù)液里，然后再放入-20度冰箱。所有樣品采完后用冰盒運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，中間大概有2天不到的時(shí)間，回來后全部解凍了，冰盒估計(jì)10幾度的樣子。不過這樣本人感覺RNA應(yīng)該不會(huì)降解很嚴(yán)重，RNA保護(hù)液上說-20度可以保持3個(gè)月，25度保存1-2周，試劑為國(guó)產(chǎn)試劑，再差應(yīng)該不可能全部降解。 二，RNA提取 買的提取液提取的，所有操作與要用的試劑儀器等都有過用DEPC處理，先是買的索萊寶的（國(guó)產(chǎn)試劑，質(zhì)量差，老板省錢要找便宜的買），沒出條帶。后來買的上海生工的，依然沒出條帶。最后買了百泰克的RNA組織提取液才提出來，OD260/280 1.8-1.99。條帶不是很清楚，但是可以清楚看到有兩條帶，但是18:28沒有1:2，大多情況下只有1:1，有時(shí)候還2:1.圖片見于附件，有幾張比較好的沒傳上去。 三，逆轉(zhuǎn)錄 這一步是用試劑盒的，用的百泰克的cDNA一步法合成的。合成的總體系是20ul，沒有稀釋直接做模板，為了驗(yàn)證cDNA合成是否成功，本人跑過膠，也跑過內(nèi)參。膠呈smear，內(nèi)參有條帶，都是很亮的。這證明cDNA這步應(yīng)該沒啥問題。 四，PCR 這一步就是最關(guān)鍵了，本人設(shè)計(jì)了4對(duì)引物，1對(duì)從文獻(xiàn)上找的，人家是做小鼠的。兩對(duì)是在cDNA的 CDS序列兩端設(shè)計(jì)的，取的相對(duì)保守的區(qū)域設(shè)計(jì)的（這兩對(duì)剛學(xué)會(huì)設(shè)計(jì)引物時(shí)設(shè)計(jì)的，估計(jì)PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)而且引物也不太好，PCR產(chǎn)物2600BP），條帶沒出。后來我比對(duì)了幾種動(dòng)物的cDNA序列，大小鼠，人，兔子，黑猩猩，金黃地鼠。找到他們的cDNA相同的地方，用PP5.0設(shè)計(jì)了一對(duì)分?jǐn)?shù)93分的引物，3‘端取的是嚴(yán)格保守區(qū)，就是幾種動(dòng)物一致的地方，5’端有1到兩個(gè)堿基不是最保守的，產(chǎn)物1000BP多點(diǎn)，Tm一個(gè)52度，一個(gè)54度，從45到55進(jìn)行梯度PCR也沒出條帶。這三對(duì)引物試了近半個(gè)月，換了幾十次模板和條件都一直沒出結(jié)果。最后一對(duì)是文獻(xiàn)上的，有目的條帶，條帶比較暗，PCR產(chǎn)物送去測(cè)序沒成功說濃度不夠，后來沒辦法就做了下TA克隆，測(cè)序回來是假陽性(附件中菌液測(cè)序是雙向測(cè)序沒拼接的，其他兩個(gè)是用菌液做的PCR出的產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果)，都不是我的那種酶的基因。最杯具的發(fā)生了，偶然做了下空白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白也有條帶，而且和第四對(duì)引物的位置一樣，剛開始以為是污染，就所有試劑什么的全換了，結(jié)果空白還是有條帶，而且跟目的條帶一個(gè)位置。最后懷疑是不是百泰克的酶有問題，換了TAKARA的RTAQ酶，這下一跑PCR，第四對(duì)引物也沒有條帶，自此證明第四條引物為假陽性，擴(kuò)增的是TAG酶里面的大腸桿菌基因組的一個(gè)片段，和我目的片段非常相似，460BP左右。沒辦法，只有從新設(shè)計(jì)引物。現(xiàn)在引物正在合成中。 本人大概的實(shí)驗(yàn)流程就這樣了，附件附有所有的實(shí)驗(yàn)圖與引物和在NCBI里查的cDNA序列。懇請(qǐng)哪位高人幫我看看到底是哪出問題了？再懇請(qǐng)大家是否能依照附件的序列幫我設(shè)計(jì)一些好的引物，或者是簡(jiǎn)并引物。 謝謝大家！祝大家實(shí)驗(yàn)成功，天天開心。 附件下載地址：http://www.rayfile.com/files/5e6 ... -b91c-0015c55db73d/ |
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2樓2011-07-04 22:05:17
gwbk
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看了樓主的引物資料，發(fā)現(xiàn)引物是以大鼠和小鼠為模板進(jìn)行設(shè)計(jì)的。 但是高原鼠兔和兔子是近親，和大鼠小鼠親緣關(guān)系？為什么不多參考兔子DNA或者CDS序列為模板進(jìn)行引物設(shè)計(jì)呢？ 有目的條帶的那一組直接溶液回收做模板，做一個(gè)二次PCR看看亮不亮。 做Touchdown也是不錯(cuò)的選擇，Touchdown和梯度各有優(yōu)點(diǎn)，可是嘗試一下。 |
3樓2011-07-04 23:02:47
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