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[交流]
關(guān)于基因工程藥物在CHO細胞中的表達問題
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戰(zhàn)友們,大家好!小弟想做基因工程藥物在CHO細胞中的大規(guī)模表達培養(yǎng)。有以下幾個問題: 1.關(guān)于外源基因轉(zhuǎn)入CHO細胞:我想問問載體的選擇對于后面的表達量影響大么,不同的載體會造成表達量的巨大差異么??(如果哪位戰(zhàn)友做過這方面的工作并獲得較大產(chǎn)量,那么你們用什么載體呢?)還有就是轉(zhuǎn)染策略:是選擇貼壁細胞轉(zhuǎn)染、篩選成功之后再馴化成懸浮培養(yǎng)還是直接用CHO的懸浮細胞轉(zhuǎn)染呢?另外,采用哪種方法轉(zhuǎn)染效率高并且利用篩選到轉(zhuǎn)入目標質(zhì)粒的陽性細胞株呢? 2.有什么方法可以克服懸浮之后的細胞成團問題,也就是說能夠?qū)崿F(xiàn)細胞的高密度、不結(jié)團的大量表達么?? 3.有木有自制的無血清培養(yǎng)基?自制培養(yǎng)基需要考慮哪些加入物質(zhì)? |
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穩(wěn)定表達對基因載體的要求不高,關(guān)鍵是看你基因插入的位點。市場上有定點整合的質(zhì)粒載體,可以使你的基因整合到轉(zhuǎn)錄頻率高的地方。 一般是先轉(zhuǎn)染,然后篩選,馴化為無血清懸浮培養(yǎng)。 如果細胞懸浮培養(yǎng)時持久地結(jié)團,可在生長液中加入50μg/ml 的胰 蛋白酶;3,5個細胞成團沒事! 實現(xiàn)高產(chǎn)量表達,細胞株和細胞密度是兩個關(guān)鍵因素。多篩幾株備用,細胞密度主要的影響還是培養(yǎng)基等。 自制培養(yǎng)基可以,不過沒有幾年的功夫拿不下來。 把上面的問題都搞透了,沒有三兩年的功夫不好弄。加油! |
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