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這膠是怎么了？小女子求解
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聚丙烯酰胺凝膠，DNA。問題： 1 這么窄的泳道，好不好，我看好多人發(fā)的論文都是寬泳道，而且這板子上樣量好小，我上到3微升就有可能溢出來。 2 為什么染色，背景色不均勻�？煞窳信e盡可能多的原因，我再一一排除。 3 4條比較清楚的都是DL2000MARKER,為什么染色時(shí)，marker總是比樣品的條帶顯現(xiàn)快 小女子這廂先謝過啦(*^__^*) 嘻嘻 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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anlewo7777
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+4): good！ 2011-07-21 11:40:09
西瓜(金幣+2, EPI+1): 補(bǔ)上 2011-07-21 11:40:50
墨池(金幣+1): 2011-07-21 21:02:55
西瓜(金幣+4): good！ 2011-07-21 11:40:09
西瓜(金幣+2, EPI+1): 補(bǔ)上 2011-07-21 11:40:50
墨池(金幣+1): 2011-07-21 21:02:55
| 選寬還是窄泳道，是看你需要不需要將所有的樣品呈現(xiàn)在一張圖上，如果希望所有的樣品都顯現(xiàn)的話，就用窄的泳道；背景顏色深淺不一，和你擴(kuò)增的結(jié)果差別大有關(guān)，需要你優(yōu)化擴(kuò)增的體系，在我看來，你的模板量可能有點(diǎn)多，擴(kuò)增的Ta值選的不好；染色時(shí)，marker顯色快，是因?yàn)樗渲械臈l帶濃度大且集中。 |
2樓2011-07-20 22:32:05
空谷幽風(fēng)
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西瓜(金幣+5, EPI+1): Good！跟沙發(fā)發(fā)表的時(shí)間間隔不到1分鐘呢，呵呵~ 2011-07-21 11:42:15
墨池(金幣+1): 2011-07-21 21:03:03
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good！跟沙發(fā)發(fā)表的時(shí)間間隔不到1分鐘呢，呵呵~ 2011-07-21 11:42:15
墨池(金幣+1): 2011-07-21 21:03:03
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（1）關(guān)于發(fā)論文是用寬泳道還是窄泳道的圖片我不太清楚，不過泳道越寬，通量越小，如果你一塊膠上必須要點(diǎn)這么多樣的話你用寬泳道來跑估計(jì)不夠吧 （2）關(guān)于背景顏色不一致，這是與你樣品的濃度來決定的，上樣量越大（是質(zhì)量不是體積），條帶顏色越深，背景也就相應(yīng)的顏色越深，有了這次的經(jīng)驗(yàn)，下次上樣的時(shí)候你可以適當(dāng)調(diào)整不同樣品的上樣量，那么背景就顏色就比較一致了 （3）mark的條帶濃度比較大，所以會(huì)在顯色的時(shí)候最先出現(xiàn)，原理同（2） |
3樓2011-07-20 22:32:50
空谷幽風(fēng)
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墨池(金幣+1): 2011-07-21 22:02:58
dhd997(金幣+5): good 2011-07-22 08:19:37
墨池(金幣+1): 2011-07-21 22:02:58
dhd997(金幣+5): good 2011-07-22 08:19:37
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同一泳道內(nèi)背景染色有深有淺，這里的背景是你的PCR體系非特異擴(kuò)增產(chǎn)生的，那里有了一定量的DNA，而且在大小上是連續(xù)的，顏色深淺代表了DNA量的不一樣；Ta值我指的是變性溫度，你做的可能是隨機(jī)引物在基因組里的擴(kuò)增，用的變性溫度比較低，所以擴(kuò)增不特異；我說你的模板可能有點(diǎn)多，是以我自己的經(jīng)驗(yàn)來的，依據(jù)是擴(kuò)增不特異，你可以在數(shù)量級的水平上減少模板量，看看所謂的‘背景“是否會(huì)變輕，可能圖會(huì)漂亮些。 另，空谷蟲友所說的通量在這里我理解是一塊膠可以上樣的數(shù)量的多少 |
7樓2011-07-21 21:52:47
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墨池(金幣+1): 2011-07-21 22:00:43
dhd997(金幣+5): good 2011-07-22 08:19:48
墨池(金幣+1): 2011-07-21 22:00:43
dhd997(金幣+5): good 2011-07-22 08:19:48
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1 這么窄的泳道，好不好，我看好多人發(fā)的論文都是寬泳道，而且這板子上樣量好小，我上到3微升就有可能溢出來。 你是用的長城齒梳子吧，可以選寬的試試，但是感覺這不是重點(diǎn)。 2 為什么染色，背景色不均勻�？煞窳信e盡可能多的原因，我再一一排除。 染色后背景色不均勻的問題，可能原因：1 玻璃板沒有洗干凈，玻璃板一定要洗干凈，且用去離子水沖洗；2. PCR擴(kuò)增體系不理想，導(dǎo)致非特異片段集中在上部，跑不下來；3. 染色時(shí)加入的顯影液不勻或?yàn)閾u晃(不會(huì)特別影響)。 3 4條比較清楚的都是DL2000MARKER,為什么染色時(shí)，marker總是比樣品的條帶顯現(xiàn)快 PCR產(chǎn)物上樣量太少，結(jié)合的陰離子就少，顯影肯定就慢且不明顯。 建議跟實(shí)驗(yàn)室的師姐、師兄多學(xué)學(xué)，我也正在學(xué)習(xí)中，祝順利。 |
8樓2011-07-21 21:55:32
9樓2011-07-21 22:02:22
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