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反轉(zhuǎn)錄后PCR無(wú)條帶
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我多次提取RNA OD值一直在1.4-1.6之間，反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增條帶均無(wú)發(fā)發(fā)擴(kuò)初目的條帶來(lái)。 另外我想知道反轉(zhuǎn)錄的cDNA能不通過(guò)PCR后檢測(cè)嗎，也就是反轉(zhuǎn)錄好了直接跑膠！ 目的條帶長(zhǎng)670bp，Tm值為 59.58,56.84℃，臥我采用的是53度。 體系是： 水 14.4 buffer 2 (2.5μM)dNTP 1.6 cDNA 1 (10μM)引物 各 0.4 酶 0.2 [ Last edited by tanxi125 on 2011-7-21 at 18:06 ] |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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5樓2011-07-21 19:42:53
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反向PCR操作應(yīng)該注意 1.分離的基因組DNA應(yīng)該達(dá)到一定純度，以利用后面的酶切、連接盒PCR擴(kuò)增。還要足以用超濾方法除去乙醇，不然連接反應(yīng)會(huì)有困難。DNA溶解于TE緩沖溶液中，pH=8.0。 2.基因組DNA的復(fù)雜程度不要太高，一般大于10的9次方的基因組需要構(gòu)建一些小一些的基因文庫(kù)。 3.對(duì)于限制性內(nèi)切酶的選擇有一定要求。（1）一般需要限制性內(nèi)切酶需要把DNA切割為2-3Kb的片段，作為反向PCR擴(kuò)增片段比較好，如果太短可能因?yàn)橐獢U(kuò)增的DNA序列中相當(dāng)部分是未知序列（因?yàn)橐矝](méi)有必要去測(cè)序，要是對(duì)于需要擴(kuò)增的DNA全部序列都測(cè)定出來(lái)了，那就不用做反向PCR了），無(wú)法提供做夠的PCR擴(kuò)增的信息，連接時(shí)可能也會(huì)有麻煩出現(xiàn)；太長(zhǎng)了反向PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系可能無(wú)法有效完成。貌似長(zhǎng)片段PCR體系尚未有效應(yīng)用于反向PCR。（2）限制性內(nèi)切酶在選擇時(shí)要考慮DNA擴(kuò)增片段的G+C 的含量。（3）酶切反應(yīng)時(shí)盡量保證在限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)條件下進(jìn)行，以避免星號(hào)活性出現(xiàn)。商業(yè)用酶試劑經(jīng)常還有相當(dāng)數(shù)量的甘油，在酶切反應(yīng)前一般應(yīng)該用超濾去除掉甘油，然后再加入有關(guān)酶的緩沖溶液，這不就用不著使用分子篩更換緩沖溶液的操作了，除非實(shí)驗(yàn)者的確非常急于練習(xí)使用分子篩更換緩沖溶液的操作，而且正好有現(xiàn)成的已經(jīng)轉(zhuǎn)配好的層析柱。  （4）一般地，粘性末端的連接效率高于平頭末端連接很多。4.被限制性內(nèi)切酶切開(kāi)的DNA片段的自身環(huán)化。 T4 DNA Ligase即T4 DNA連接酶，可以催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之間以磷酸二酯鍵結(jié)合，該催化反應(yīng)需ATP作為輔助因子。同時(shí)T4 DNA連接酶可以修補(bǔ)雙鏈DNA、雙鏈RNA或DNA/RNA雜合物上的單鏈缺刻(single-strand nicks)。T4DNA連接酶在分子生物學(xué)中有廣泛的應(yīng)用。 被限制性內(nèi)切酶切開(kāi)的DNA片段的自身環(huán)化反應(yīng)體系： 10X連接酶緩沖溶液： 10μL（購(gòu)買(mǎi)T4 DNA Ligase商家會(huì)提供，使用時(shí)稀釋10倍）,限制性內(nèi)切酶DNA片段：5μL（溶解于TE緩沖溶液中，pH=8.0）， T4 DNA 連接酶 ：1μL， 無(wú)菌水： 84μL 限制性內(nèi)切酶DNA片段終濃度一般不超過(guò) 3ng/μL，反應(yīng)體系中的T4 DNA 連接酶用量可按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)配制，一般對(duì)于上述反應(yīng)體系而言，2.5U 的T4 DNA 連接酶足夠了。被限制性內(nèi)切酶切開(kāi)的DNA片段的自身環(huán)化反應(yīng)體系可在14攝氏度的水浴中過(guò)夜（大概13-18小時(shí)），然后升溫至約65攝氏度使T4 DNA 連接酶失活已終止反應(yīng)。很多書(shū)上對(duì)于自身環(huán)化反應(yīng)的試驗(yàn)流程說(shuō)的不清楚，所以我完整寫(xiě)出來(lái)，以供參考。當(dāng)然也文獻(xiàn)上說(shuō)：被限制性內(nèi)切酶切開(kāi)的DNA片段的自身環(huán)化僅需要在16攝氏度水浴中1小時(shí)即可升溫至約65攝氏度使T4 DNA 連接酶失活已終止反應(yīng)。 （5）一般而言，被限制性內(nèi)切酶切開(kāi)的DNA片段的自身環(huán)化后，還是需要用新的針對(duì)于已知序列的那部分DNA片段進(jìn)行再次限制性酶切，形成新的已知序列的那部分DNA片段在外側(cè)的線狀DNA，這樣PCR就變成普通的PCR，效率會(huì)比直接對(duì)于環(huán)形DNA模板要高，因?yàn)橹辽侪h(huán)狀DNA要考慮到DNA由于螺旋壓緊而形成的復(fù)制阻力，PCR反應(yīng)可是沒(méi)有DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶來(lái)消除由于螺旋壓緊而形成的復(fù)制阻力，也沒(méi)有證據(jù)表明任何被限制性內(nèi)切酶切開(kāi)的DNA片段的自身環(huán)化后都會(huì)有足夠的左手螺旋足以克服由于螺旋壓緊而形成的復(fù)制阻力。 （6）第一輪PCR之后，用電泳檢測(cè)，如果目標(biāo)帶不夠窄和量，或有雜帶出現(xiàn)，一般需要進(jìn)行嵌套PCR再次擴(kuò)增，需要至少一個(gè)不同于第一次PCR的引物的新引物。 |
6樓2014-07-17 03:11:01
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