 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 6 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2844 | 回復(fù): 5 | ||
| 本帖產(chǎn)生 1 個(gè) MolEPI ，點(diǎn)擊這里進(jìn)行查看 | ||
xy19860508銅蟲(chóng) (小有名氣)
|
[求助]
反轉(zhuǎn)錄之后PCR擴(kuò)增片段問(wèn)題的請(qǐng)教，急急急
|
|
|
小弟，最近在對(duì)流感病毒的HA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增（先提RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，完成之后再進(jìn)行的擴(kuò)增），在擴(kuò)增之前為保證RNA模板的存在，先用HA基因的小片段引物（300bp）進(jìn)行擴(kuò)增，呈陽(yáng)性之后才做的大片段（1700bp）擴(kuò)增。圖1為我做的退火溫度梯度的圖片，在D,G泳道出現(xiàn)了明顯的目的條帶，但是E泳道不知道是什么東西。 但是在確定好的條件下，再用樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增是，沒(méi)有目的條帶出現(xiàn)，而呈現(xiàn)出圖2這種情況。不知道這種情況為什么東西導(dǎo)致的，求教。。(為什么同樣的反應(yīng)條件，試劑也是一樣的，則出現(xiàn)完全沒(méi)有目的條帶呢) 在找不到原因的情況下，我又重新抽提了RNA，并且也做了短片段的擴(kuò)增，沒(méi)有問(wèn)題之后。用保真酶來(lái)擴(kuò)增大的片段，則呈現(xiàn)出了以下的情況，求解答。 小弟在此求教，急啊。趕著畢業(yè)啊，請(qǐng)大家多多指點(diǎn)，拜謝了 為退火溫度優(yōu)化 保真酶的擴(kuò)增圖片 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有254人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專(zhuān)業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽(yáng)學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
湖北師范大學(xué)招調(diào)劑啦
已經(jīng)有2人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 大片段PCR擴(kuò)增求助
已經(jīng)有34人回復(fù)
- 高GC含量基因片段PCR問(wèn)題
已經(jīng)有13人回復(fù)
- PCR產(chǎn)物凝膠回收、酶切等問(wèn)題請(qǐng)教
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 基因組中長(zhǎng)片段PCR應(yīng)該注意的幾個(gè)問(wèn)題
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 反轉(zhuǎn)錄后PCR無(wú)條帶
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 請(qǐng)教real time pcr問(wèn)題，謝謝！
已經(jīng)有10人回復(fù)
- PCR擴(kuò)增出現(xiàn)的問(wèn)題
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 【求助/交流】求助：5.5KPCR片段連接難，請(qǐng)教�。�
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 【求助/交流】羊反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物做PCR,3KB,是EX TAQ好，還是LA TAQ 好
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】為什么PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度比設(shè)計(jì)時(shí)的要長(zhǎng)很多？
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【求助/交流】大片段pcr問(wèn)題
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 【求助/交流】為什么我反轉(zhuǎn)錄PCR的抗體的輕鏈基因測(cè)序后發(fā)現(xiàn)總是有終止子？
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】請(qǐng)教兩條片段通過(guò)PCR橋接擴(kuò)增的方法
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【求助/交流】PCR擴(kuò)增核心片段，再也擴(kuò)不出來(lái)了，怎么辦
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 【求助/交流】以cDNA為模板PCR擴(kuò)增目的片段時(shí)條帶較淺原因
已經(jīng)有13人回復(fù)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
xy19860508(金幣+10): 2012-02-25 12:25:26
wanhscn(金幣+5, MolEPI+1): 很好！歡迎繼續(xù)解答，必要時(shí)將授予專(zhuān)家指數(shù)！ 2012-02-25 15:56:57
xy19860508: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-05-04 12:10:31
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
xy19860508(金幣+10): 2012-02-25 12:25:26
wanhscn(金幣+5, MolEPI+1): 很好！歡迎繼續(xù)解答，必要時(shí)將授予專(zhuān)家指數(shù)！ 2012-02-25 15:56:57
xy19860508: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-05-04 12:10:31
|
1.從圖A中看，雖然你做了退火溫度的優(yōu)化，但是可以看見(jiàn)很明顯的非特異條帶，說(shuō)明你的引物的特異性并不是太好。。而且我不明白你設(shè)計(jì)300bp的目的片段作為鑒定的依據(jù)，我覺(jué)得可以把目的片段的大小設(shè)計(jì)的大點(diǎn)。 2.及時(shí)是之前鑒定的陽(yáng)性的，再下一次PCR中也有可能出不來(lái)，具體原因很多，就把它作為系統(tǒng)誤差吧，沒(méi)必要較真，只要再做兩次實(shí)驗(yàn)，能出符合自己的結(jié)果就行了。 3.高保真的擴(kuò)增效率是不及普通Taq酶的，所以酶量可以提高點(diǎn)。 我的建議： 1看你做的是AIV的哪個(gè)型，仔細(xì)考慮你的引物的特異性；。 2可以用HOFFMAN的通用引物試試，再不行重新設(shè)計(jì)引物測(cè)出你所需要的序列的全長(zhǎng)； 3在獲得一般序列的基礎(chǔ)上再調(diào)整引物用高保真酶擴(kuò)增獲得真實(shí)的全長(zhǎng)。 祝你好運(yùn)。 |
2樓2012-02-25 12:15:42
xy19860508
銅蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 69.3
- 散金: 247
- 帖子: 80
- 在線: 62.3小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1255300
- 注冊(cè): 2011-04-04
- 專(zhuān)業(yè): 獸醫(yī)傳染病學(xué)
3樓2012-02-25 12:25:06
xy19860508
銅蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 69.3
- 散金: 247
- 帖子: 80
- 在線: 62.3小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1255300
- 注冊(cè): 2011-04-04
- 專(zhuān)業(yè): 獸醫(yī)傳染病學(xué)
4樓2012-02-25 12:28:17
5樓2012-02-26 12:11:30
我恨回鍋肉
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 15
- 帖子: 1
- 在線: 51分鐘
- 蟲(chóng)號(hào): 777871
- 注冊(cè): 2009-05-23
- 專(zhuān)業(yè): 獸醫(yī)傳染病學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-05-02 13:37:25
xy19860508: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-05-04 12:10:18
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-05-02 13:37:25
xy19860508: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-05-04 12:10:18
|
300bp跑出來(lái)?xiàng)l帶不怎么亮，說(shuō)明cDNA質(zhì)量不高的可能性很大。 高保真酶的擴(kuò)增效率要低一些，可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。 建議你從提高cDNA質(zhì)量的幾個(gè)方面入手，如：1.提高病毒液里病毒的滴度；2.提高RNA提取的操作水平；3.更換反轉(zhuǎn)錄試劑，如果試劑放久了就換新的；如果是比較便宜的低端產(chǎn)品，換成高端一點(diǎn)的。takara有一個(gè)一步法RT-PCR的盒子，可以試試，比較適合新手用。4.PCR的時(shí)候cDNA用量增大一點(diǎn)。25微升體系加4微升模板試試。5.個(gè)人覺(jué)得退火溫度優(yōu)化意義不大，固定用較低溫度，比如52度左右就可以了。最多有點(diǎn)非特異行條帶，影響不大。 |
6樓2012-05-02 13:32:02
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 xy19860508 的主題更新
| 6 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 332求調(diào)劑 +5 | @MZB382400 2026-03-28 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 342求調(diào)劑 +4 | 加油a李zs 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 291求調(diào)劑 +7 | HanBeiNingZC 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
[考研] 0703 化學(xué) 求調(diào)劑，一志愿山東大學(xué) 342 分 +7 | Shern—- 2026-03-28 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 288資源與環(huán)境專(zhuān)碩求調(diào)劑，不限專(zhuān)業(yè)，有學(xué)上就行 +5 | lllllos 2026-03-30 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 287求調(diào)劑 +11 | land xuxu 2026-03-26 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 一志愿南開(kāi)大學(xué)0710生物學(xué)359求調(diào)劑 +5 | 兔兔兔111223314 2026-03-29 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0856求調(diào)劑 +8 | 楒桉 2026-03-28 | 8/400 |
|
|
|
[考博] 26申博自薦 +6 | whh869393 2026-03-24 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿南昌大學(xué)324求調(diào)劑 +5 | hanamiko 2026-03-29 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境工程 085701，267求調(diào)劑 +6 | minht 2026-03-29 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 356求調(diào)劑 +4 | gysy?s?a 2026-03-28 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑 +4 | 種圣賜 2026-03-28 | 4/200 |
|
|
|
[碩博家園] 招收生物學(xué)/細(xì)胞生物學(xué)調(diào)劑 +4 | IceGuo 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +7 | 墨墨漠 2026-03-25 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料求調(diào)劑 +5 | .m.. 2026-03-25 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 341求調(diào)劑 +7 | 青檸檬1 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 調(diào)劑 +4 | 柚柚yoyo 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 網(wǎng)絡(luò)空間安全0839招調(diào)劑 +4 | w320357296 2026-03-25 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 292求調(diào)劑 +4 | 鵝鵝鵝額額額額?/a> 2026-03-24 | 4/200 |
|