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xy19860508銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
反轉(zhuǎn)錄之后PCR擴(kuò)增片段問題的請教，急急急
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小弟，最近在對流感病毒的HA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增（先提RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，完成之后再進(jìn)行的擴(kuò)增），在擴(kuò)增之前為保證RNA模板的存在，先用HA基因的小片段引物（300bp）進(jìn)行擴(kuò)增，呈陽性之后才做的大片段（1700bp）擴(kuò)增。圖1為我做的退火溫度梯度的圖片，在D,G泳道出現(xiàn)了明顯的目的條帶，但是E泳道不知道是什么東西。 但是在確定好的條件下，再用樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增是，沒有目的條帶出現(xiàn)，而呈現(xiàn)出圖2這種情況。不知道這種情況為什么東西導(dǎo)致的，求教。。(為什么同樣的反應(yīng)條件，試劑也是一樣的，則出現(xiàn)完全沒有目的條帶呢) 在找不到原因的情況下，我又重新抽提了RNA，并且也做了短片段的擴(kuò)增，沒有問題之后。用保真酶來擴(kuò)增大的片段，則呈現(xiàn)出了以下的情況，求解答。 小弟在此求教，急啊。趕著畢業(yè)啊，請大家多多指點，拜謝了 為退火溫度優(yōu)化 保真酶的擴(kuò)增圖片 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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xy19860508(金幣+10): 2012-02-25 12:25:26
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xy19860508: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-05-04 12:10:31
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1.從圖A中看，雖然你做了退火溫度的優(yōu)化，但是可以看見很明顯的非特異條帶，說明你的引物的特異性并不是太好。。而且我不明白你設(shè)計300bp的目的片段作為鑒定的依據(jù)，我覺得可以把目的片段的大小設(shè)計的大點。 2.及時是之前鑒定的陽性的，再下一次PCR中也有可能出不來，具體原因很多，就把它作為系統(tǒng)誤差吧，沒必要較真，只要再做兩次實驗，能出符合自己的結(jié)果就行了。 3.高保真的擴(kuò)增效率是不及普通Taq酶的，所以酶量可以提高點。 我的建議： 1看你做的是AIV的哪個型，仔細(xì)考慮你的引物的特異性；。 2可以用HOFFMAN的通用引物試試，再不行重新設(shè)計引物測出你所需要的序列的全長； 3在獲得一般序列的基礎(chǔ)上再調(diào)整引物用高保真酶擴(kuò)增獲得真實的全長。 祝你好運(yùn)。 |
2樓2012-02-25 12:15:42
xy19860508
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3樓2012-02-25 12:25:06
xy19860508
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4樓2012-02-25 12:28:17
5樓2012-02-26 12:11:30
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xy19860508: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-05-04 12:10:18
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300bp跑出來條帶不怎么亮，說明cDNA質(zhì)量不高的可能性很大。 高保真酶的擴(kuò)增效率要低一些，可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。 建議你從提高cDNA質(zhì)量的幾個方面入手，如：1.提高病毒液里病毒的滴度；2.提高RNA提取的操作水平；3.更換反轉(zhuǎn)錄試劑，如果試劑放久了就換新的；如果是比較便宜的低端產(chǎn)品，換成高端一點的。takara有一個一步法RT-PCR的盒子，可以試試，比較適合新手用。4.PCR的時候cDNA用量增大一點。25微升體系加4微升模板試試。5.個人覺得退火溫度優(yōu)化意義不大，固定用較低溫度，比如52度左右就可以了。最多有點非特異行條帶，影響不大。 |
6樓2012-05-02 13:32:02
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