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wuweibewin金蟲 (正式寫手)
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[求助]
PCR有關(guān)問題
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本人從師姐那里獲得了一對引物，用于棉花基因組中某個外源基因的檢測。我用這個引物也用了有兩年了吧，一直雖然有雜帶，但是可以找到清晰的目的帶。 結(jié)果不知道為何，從今年六月份開始，不知怎么回事，這天引物突然失靈了一般，不論怎么試，除了質(zhì)粒有帶，其余株系都沒有帶，連非特異性帶都沒有�。暶魇ъ`的前一晚上我還做出來了，第二天突然就不知怎么回事就P不出來了）！然后我在以前的條件下（退火溫度和體系相同），做了至少20多次，結(jié)果全部一樣，各株系均沒帶（正常下陰性也有大量非特異擴增）！ 于是我 首先利用其它基因的引物對這一批DNA進行擴增，發(fā)現(xiàn)能夠擴增出來；同時我又提取了一些新的樣品，結(jié)果仍然一樣——我覺得可以證明DNA樣品問題不大！ 然后我讓我?guī)熋煤屯瑢W(xué)替我做了幾次，結(jié)果和我做的一樣，我PCR操作至少也做了百八十批了！---操作應(yīng)該沒有問題 PCR儀使用的是EPPENDOF和thermo的，用于擴增其他基因都沒有問題————排除PCR故障 引物我前后利用華大和博尚合成了三四批，均得到同樣結(jié)果，引物序列均能在基因序列上找到，且與之前報告單序列完全一樣 我同時利用PCR儀進行了多次溫度梯度PCR，結(jié)果所有溫度梯度結(jié)果也都是一樣！ taq酶利用TAKARA和北京全是金結(jié)果基本一致，且換用多個批次的taq酶！沒有結(jié)果！同時taq酶對其他基因的擴增良好！ PCR的體系完全根據(jù)taq酶說明書進行！也曾經(jīng)嘗試過TAQ的濃度梯度/dntp濃度梯度/MG離子梯度，無果！ 這個問題讓人很是頭疼！ 異常發(fā)現(xiàn)：發(fā)現(xiàn)凝膠電泳的500bp一下，呈涂抹狀，我認(rèn)為是大量引物沒有反應(yīng)導(dǎo)致的引物二聚體，但或許有其他原因！ 我為此已經(jīng)進行了90多輪PCR，換了400多個樣品（十批）！ 還請各位高手批評指正�。�！不勝感激��！ 之前的結(jié)果 現(xiàn)在結(jié)果 部分批次模板電泳 mg離子梯度 溫度梯度 Dntp梯度 taq梯度 模板濃度梯度 [ Last edited by wuweibewin on 2011-7-24 at 22:25 ] |
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