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保護你的大樹新蟲 (小有名氣)
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[求助]
引物設(shè)計
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各位大蝦，我現(xiàn)在在設(shè)計一個名叫suv39h1基因的引物，最后連接到N1載體上面去，導(dǎo)師讓我在設(shè)計引物的時候把下游的TAG終止密碼子給去掉，所以下游的選擇空間很小，只能緊挨著TAG前面設(shè)計下游引物，前面一次已經(jīng)設(shè)計了一次，F(xiàn) ctcgagGGAAAGATGGCGGAAAAT R cttaaggGAAGAGGTATTTGCGGCAG 但是可能是上下引物互補太厲害了（-5.3kcal/mol)上下引物tm值大概在62，如果調(diào)到67是否可以，現(xiàn)在我想是否可以先擴下TAG，然后在此基礎(chǔ)上繼續(xù)設(shè)計引物，這是下下策，我想問下除了這種方法還有什么好的方法。謝謝哈 |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5, MolEPI+1): good 2011-08-01 08:20:40
保護你的大樹(金幣+10): 非常的感謝，我想再問問你用的軟件是不是oligo5��？還有為什么在F端得酶切位點上加TAT，在R端得酶切位點上加TAG,這幾個堿基我看了下也不是什么保護堿基，而加他們的原因是什么呢？ 2011-08-01 16:59:22
保護你的大樹(金幣+10): 謝謝哈，我現(xiàn)在已經(jīng)基本上懂了，只是想再問問，你先說XhoI是需要加引物的，而EcorI是可以不加引物的，這些都是在PCR后連在18T載體上的基礎(chǔ)上還是在PCR后直接酶切連在目的載體的基礎(chǔ)上？哪些酶切位點是必須加保護堿基的，哪些酶切位點是可以不加保護堿基的。 2011-08-02 08:57:11
dhd997(金幣+5, MolEPI+1): good 2011-08-01 08:20:40
保護你的大樹(金幣+10): 非常的感謝，我想再問問你用的軟件是不是oligo5��？還有為什么在F端得酶切位點上加TAT，在R端得酶切位點上加TAG,這幾個堿基我看了下也不是什么保護堿基，而加他們的原因是什么呢？ 2011-08-01 16:59:22
保護你的大樹(金幣+10): 謝謝哈，我現(xiàn)在已經(jīng)基本上懂了，只是想再問問，你先說XhoI是需要加引物的，而EcorI是可以不加引物的，這些都是在PCR后連在18T載體上的基礎(chǔ)上還是在PCR后直接酶切連在目的載體的基礎(chǔ)上？哪些酶切位點是必須加保護堿基的，哪些酶切位點是可以不加保護堿基的。 2011-08-02 08:57:11
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1，樓主的酶切位點是Xho I/EcoR I，Xho I需要加保護堿基的，EcoR I加不加無所謂。 2，加完保護堿基后，3'端互補情況仍然沒有得到解決，采用延長引物方法消除不了上下游引物的互補情況，加TAG也不能解決這個問題的。 3，可以減少R的3'端堿基數(shù)量，如：F TATctcgagGGAAAGATGGCGGAAAAT R TAGcttaaggGAAGAGGTATTTGC（本設(shè)計僅供參考�。� 4，特別強調(diào)的是，樓主可以通過減少3'端堿基數(shù)量重新設(shè)計這個引物（引物與模板互補序列不少于12bp就可以了）。 修改前 修改后 |
2樓2011-07-31 23:59:42
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3樓2011-08-01 19:09:25
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4樓2011-08-02 08:52:20
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5樓2011-08-02 19:22:37
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