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保護(hù)你的大樹(shù)新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
引物設(shè)計(jì)
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各位大蝦，我現(xiàn)在在設(shè)計(jì)一個(gè)名叫suv39h1基因的引物，最后連接到N1載體上面去，導(dǎo)師讓我在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候把下游的TAG終止密碼子給去掉，所以下游的選擇空間很小，只能緊挨著TAG前面設(shè)計(jì)下游引物，前面一次已經(jīng)設(shè)計(jì)了一次，F(xiàn) ctcgagGGAAAGATGGCGGAAAAT R cttaaggGAAGAGGTATTTGCGGCAG 但是可能是上下引物互補(bǔ)太厲害了（-5.3kcal/mol)上下引物tm值大概在62，如果調(diào)到67是否可以，現(xiàn)在我想是否可以先擴(kuò)下TAG，然后在此基礎(chǔ)上繼續(xù)設(shè)計(jì)引物，這是下下策，我想問(wèn)下除了這種方法還有什么好的方法。謝謝哈 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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1，NEB給的保護(hù)堿基表現(xiàn)在也不怎么用了，加保護(hù)堿基不是嚴(yán)格按照那個(gè)表加的，可以根據(jù)引物GC含量調(diào)整保護(hù)堿基，推薦的保護(hù)堿基個(gè)數(shù)最好不變。 2，這是用oligo7得到的數(shù)據(jù)。 3，加上的那幾個(gè)堿基是保護(hù)堿基的，我調(diào)整了一下，并不是按照NEB表格加的。 4，我設(shè)計(jì)引物的時(shí)候，如果加的堿基太多，保守起見(jiàn)，引物和模板重疊序列至少有15b，很少失敗，12bp太極限，沒(méi)試過(guò)。 oligo評(píng)估、引物設(shè)計(jì)如果有問(wèn)題，可以回帖或者站內(nèi)信通知我 |
3樓2011-08-01 19:09:25
gwbk
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5, MolEPI+1): good 2011-08-01 08:20:40
保護(hù)你的大樹(shù)(金幣+10): 非常的感謝，我想再問(wèn)問(wèn)你用的軟件是不是oligo5��？還有為什么在F端得酶切位點(diǎn)上加TAT，在R端得酶切位點(diǎn)上加TAG,這幾個(gè)堿基我看了下也不是什么保護(hù)堿基，而加他們的原因是什么呢？ 2011-08-01 16:59:22
保護(hù)你的大樹(shù)(金幣+10): 謝謝哈，我現(xiàn)在已經(jīng)基本上懂了，只是想再問(wèn)問(wèn)，你先說(shuō)XhoI是需要加引物的，而EcorI是可以不加引物的，這些都是在PCR后連在18T載體上的基礎(chǔ)上還是在PCR后直接酶切連在目的載體的基礎(chǔ)上？哪些酶切位點(diǎn)是必須加保護(hù)堿基的，哪些酶切位點(diǎn)是可以不加保護(hù)堿基的。 2011-08-02 08:57:11
dhd997(金幣+5, MolEPI+1): good 2011-08-01 08:20:40
保護(hù)你的大樹(shù)(金幣+10): 非常的感謝，我想再問(wèn)問(wèn)你用的軟件是不是oligo5��？還有為什么在F端得酶切位點(diǎn)上加TAT，在R端得酶切位點(diǎn)上加TAG,這幾個(gè)堿基我看了下也不是什么保護(hù)堿基，而加他們的原因是什么呢？ 2011-08-01 16:59:22
保護(hù)你的大樹(shù)(金幣+10): 謝謝哈，我現(xiàn)在已經(jīng)基本上懂了，只是想再問(wèn)問(wèn)，你先說(shuō)XhoI是需要加引物的，而EcorI是可以不加引物的，這些都是在PCR后連在18T載體上的基礎(chǔ)上還是在PCR后直接酶切連在目的載體的基礎(chǔ)上？哪些酶切位點(diǎn)是必須加保護(hù)堿基的，哪些酶切位點(diǎn)是可以不加保護(hù)堿基的。 2011-08-02 08:57:11
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1，樓主的酶切位點(diǎn)是Xho I/EcoR I，Xho I需要加保護(hù)堿基的，EcoR I加不加無(wú)所謂。 2，加完保護(hù)堿基后，3'端互補(bǔ)情況仍然沒(méi)有得到解決，采用延長(zhǎng)引物方法消除不了上下游引物的互補(bǔ)情況，加TAG也不能解決這個(gè)問(wèn)題的。 3，可以減少R的3'端堿基數(shù)量，如：F TATctcgagGGAAAGATGGCGGAAAAT R TAGcttaaggGAAGAGGTATTTGC（本設(shè)計(jì)僅供參考！） 4，特別強(qiáng)調(diào)的是，樓主可以通過(guò)減少3'端堿基數(shù)量重新設(shè)計(jì)這個(gè)引物（引物與模板互補(bǔ)序列不少于12bp就可以了）。 修改前 修改后 |
2樓2011-07-31 23:59:42
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4樓2011-08-02 08:52:20
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5樓2011-08-02 19:22:37
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