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[交流]
一小段文獻中方法的問題？？？有點沒看明白
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本人新手，在一篇文獻上學習一個蛋白的純化步驟，這個蛋白用的是TEV-HIS TAG , 而且還有GST標簽，我不大明白，為什么這么繁瑣，只用HIS或者GST不行么？一下是這段的原文 The supernatant was loaded onto a glutathione sepharose column (GE Healthcare). After extensive washing with 20mM Tris buffer pH 8.0, 500mM NaCl, 1mM DTT, the GSTmoiety was cleaved by His-tagged TEV protease in the same wash buffer at 4°C overnight. The protein was passed through a Ni2+- NTA agarose column (Qiagen) to eliminate the His-tagged TEV protease, |
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
silicare(金幣+5, BioEPI+1): 2011-08-10 12:05:50
loveskyzhou(金幣+2): 謝謝 2011-08-10 12:55:27
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silicare(金幣+5, BioEPI+1): 2011-08-10 12:05:50
loveskyzhou(金幣+2): 謝謝 2011-08-10 12:55:27
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直譯一下： 分裝上清至谷胱甘肽收集柱(GE Healthcare)，用20mM Tris buffer pH 8.0, 500mM NaCl, 1mM DTT充分洗滌后，再用相同的buffer4℃浸泡過夜，部分GST被His-tagged TEV 蛋白酶剪切。隨后該蛋白通過Ni2+- NTA 瓊脂糖分離柱（Qiagen）去除His-tagged TEV 蛋白酶。 |
2樓2011-08-09 20:58:15
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
adslye(金幣+5): 解釋地很清楚了，感謝交流！ 2011-08-29 09:53:30
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
adslye(金幣+5): 解釋地很清楚了，感謝交流！ 2011-08-29 09:53:30
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簡單的說，（目的蛋白-GST）首先結合于glutathione sepharose column，然后通過加入His-tagged TEV protease （蛋白酶）切斷目的蛋白和GST之間的連接肽，再加入buffer就可以把目的蛋白洗脫下來，柱子上則剩余結合的GST。 洗脫出的目的蛋白里面還有His-tagged TEV protease雜質，這部分通過Ni柱和His-tagged TEV protease特異性結合而去掉，最后溶液中就只有目的蛋白了。 這個方法是目前用的比較多的一種純化方法，但通過這些親和吸附之類的辦法純化蛋白質，最后都必須將諸如Histag、GST和CBD之類的標記tag去掉。蛋白酶方法是實驗室里常用的一種。另外也有包括化學法（例如羥胺和溴化氫）、內(nèi)含肽（intein）之類的等等其他手段。 |
3樓2011-08-10 15:27:51
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