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12zhangwei新蟲 (小有名氣)
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[求助]
提出來(lái)是一回事，提得好是另外一回事-----RNA
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心哇涼哇涼地，電泳檢測(cè)RNA條帶是好的，可是測(cè)完吸光值之后，才明白又得從頭再來(lái)。提了五個(gè)樣 濃度(ng/ul) A260/A280 51.3 1.4 36.9 1.28 57. 1 1.34 56.8 1.3 25.1 1.35 僅拿出一個(gè)樣來(lái)說(shuō)，其A260=0.628 A280=0.466 A260/230=0.44 知道這些值的意義，是蛋白污染嗎，取上清已經(jīng)很小心了，別人說(shuō)煙草的濃度差不多應(yīng)該在1000多。唉 |
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gwbk
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7樓2011-08-11 10:34:48
gwbk
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜(金幣+3): Good 2011-08-10 23:19:30
12zhangwei(金幣+1): 2011-08-11 09:01:55
西瓜(金幣+2): 代樓主發(fā) 2011-08-13 00:28:07
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1，“分子克隆”第三版有下面兩段話： DNA 和 RNA 純制品的 OD260:OD280 值分別是 1.8 和 2.0，若樣品中蛋白或酚的污染較嚴(yán)重，則 OD260:OD280 低于上述兩個(gè)數(shù)值 (p1695 倒數(shù)第 5 行)。水飽和酚在 270nm 處有特征性吸收，其 OD260:OD280（此處疑似為270:280，原因參見(jiàn)：http://www.med66.com/html/ziliao ... ecd07108a85983f.htm） 比值為 2 (p1697 的框內(nèi)倒數(shù)第 2 行)。 2，260nm、230nm、下的吸光度分別代表了核酸、鹽濃度的吸光度值，OD260/OD230<2說(shuō)明去鹽不充分，可以再次沉淀和70%乙醇洗滌。 ，A230nm處有強(qiáng)吸收，有酚鹽離子、硫氰酸鹽或者其他有機(jī)化合物污染（分子克�。簆1697）OD260/230 大大低于 2，但 OD260，OD280 幾乎不變。 3，樣品中A260/A280低于2，A260/A230也低于2.0，可能存在蛋白質(zhì)污染、鹽離子沒(méi)有除干凈等問(wèn)題。 4，關(guān)于A260/A280判斷純度的正確性問(wèn)題。 通常，使用 A260/A280 判斷核酸的純度。A260/A280 是一個(gè)給大家?guī)?lái)許多困惑的指標(biāo)。以RNA為例，首先要明確該指標(biāo)用于核酸的原始含義是：純的 RNA，其 A260/A280 = 2.0 左右。純 RNA 是‘因’，A260/A280 = 2 是‘果’�，F(xiàn)在大家卻在拿 A260/A280 當(dāng)‘因’用，認(rèn)為“如果 A260/A280 = 2，所以 RNA 是純的”，自然會(huì)產(chǎn)生困惑。有興趣的話，可以在你的 RNA 樣品中加入一點(diǎn)抽提中經(jīng)常使用的試劑，如苯酚，異硫氰酸胍，PEG 等，再測(cè) A260/A280 比值�，F(xiàn)實(shí)是，許多抽提 RNA 時(shí)使用的試劑，以及樣品中的許多雜質(zhì)都在 A260 和 A280 處附近有吸收，對(duì) A260/A280 產(chǎn)生影響。 目前最具有指導(dǎo)性的做法是：對(duì) RNA 樣品在 200-300 nm 范圍掃描。純 RNA 的曲線具有如下特點(diǎn)：曲線平滑，A230 和 A260 是兩個(gè)拐點(diǎn)，A300 接近 0，A260/A280 = 2 左右，A260/A230 = 2 左右，A260/A215 = 1 左右。如果沒(méi)有掃描數(shù)據(jù)，除了測(cè)定 A260/A280 比值外，也一定要測(cè)定 A260/A230 比值，因?yàn)樵摫戎祵?duì)所有影響酶反應(yīng)的雜質(zhì)的殘留更敏感。另外，要考慮設(shè)備的線形范圍 (如 A260 要處于 0.1 - 0.5 之間)，超出線形范圍的讀數(shù)沒(méi)有太大參考價(jià)值的。另外有兩個(gè)有趣的現(xiàn)象：在水中測(cè)定 A260/A280，比值將變低 0.3 左右；而在 10mM EDTA 中測(cè)定的比值比在 1mM EDTA 中測(cè)定的高 0.2 左右。這兩點(diǎn)也是要注意的，所以當(dāng)我們用DEPC處理過(guò)的水溶解RNA并測(cè)定其260/280比值的時(shí)候，往往都是小于2.0的。 此段來(lái)源于：http://blog.163.com/qcp_0451/blog/static/13604755520100254040361/ |
2樓2011-08-10 22:52:06
w2boluo
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜(金幣+4): 很有經(jīng)驗(yàn)�。� 2011-08-10 23:19:16
西瓜(金幣+2): 代樓主發(fā) 2011-08-13 00:28:27
西瓜(金幣+4): 很有經(jīng)驗(yàn)�。� 2011-08-10 23:19:16
西瓜(金幣+2): 代樓主發(fā) 2011-08-13 00:28:27
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你用的比色杯是多少微升的？這個(gè)很關(guān)鍵。 一般而言，我們用的紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)只有在OD值0.1到1之間才比較準(zhǔn)，低于0.1或者高于1，都要打折扣。電泳圖片好才是真的好。 我用過(guò)的杯子50ul的塑料杯，比較準(zhǔn)，100ul的石英杯是不折不扣的杯具，讀數(shù)任何時(shí)候都在亂跳。了解一下別人的OD值指標(biāo)如何也行。 但多數(shù)時(shí)刻，我們提的RNA由于體積不夠，都必須稀釋，稀釋后的吸光度必須落在0.1到1之間。如果電泳圖片好，我選擇無(wú)視吸光度，直接反轉(zhuǎn)錄。 |
3樓2011-08-10 22:53:15
gwbk
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4樓2011-08-10 23:03:08
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