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wzhgaochuan新蟲 (小有名氣)
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玉米轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)中遇到的問題
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最近一直在做玉米轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)，但是總也沒有目的帶。想知道是怎么做的，基因組有什么要求OD260: OD280為多少，多少納克。具體的體系等等，我的引物最適合退火為53度。目的基因1400bp. 麻煩大家?guī)鸵幌旅Π。敝厴I(yè)，要是出不來結(jié)果會(huì)被延期啊~~· |
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【答案】應(yīng)助回帖
wzhgaochuan(金幣+2): 謝謝您的回答啦，受益匪淺，希望試驗(yàn)?zāi)艹鰜怼?2011-08-12 15:49:36
| 寫的太不詳細(xì)了。是自己做的轉(zhuǎn)基因植株的驗(yàn)證，還是市面上買來的玉米面的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)？不管哪種，都不該用1.4k的檢測(cè)pcr，太長了，300-500還差不多。直接從葉片提基因組比較簡(jiǎn)單，用于做pcr模板的話，質(zhì)量要求不是那么高。建議多了解一下轉(zhuǎn)基因的插入序列，只選目的基因的一段用來做pcr，只要這一段是野生型玉米里面沒有的就行。 |
2樓2011-08-12 09:31:02
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3樓2011-08-12 10:49:26
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4樓2011-08-12 11:44:49
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5樓2011-08-12 15:05:47
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| 我的反應(yīng)體系：即在25μL體系中，模板DNA50-160ng（3-8ul），1×PCR buffer，dNTPs62．5pmol／μL，Primers0．25pmol／μL，Taq DNA polymerase1.25U。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10min；94℃變性50S，54℃退火40S，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。也試過降落PCR.61-51℃各一個(gè)循環(huán)，最后在55℃變性24個(gè)循環(huán)。最后也是沒有目的條帶。PP5上引物退火溫度為Tm [°C] 57.8 和58.7，產(chǎn)物的 Ta Opt [°C] 為 54.3。目的帶為893bp |
6樓2011-08-12 17:31:49
7樓2011-08-13 15:03:47
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8樓2011-08-13 17:15:10
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模板是試劑盒提的還是ctab法提的？如果是后者，雜質(zhì)含量一般不低，25ul體系里加這么多實(shí)在是多了。模板減少點(diǎn)試試，像這種濃度的，幾個(gè)ng的模板已經(jīng)足夠了，個(gè)人傾向于使用0.5-1ul模板。pp5的計(jì)算值一般偏高，引物在20個(gè)堿基左右可以直接用2XAT個(gè)數(shù)+4XGC個(gè)數(shù)的經(jīng)驗(yàn)公式估算，我一般是直接先用50度或者48度試試。酶體系也很關(guān)鍵，893bp用takara的extaq和rtaq擴(kuò)增一般很不給力，我會(huì)直接用LA，樓上很多人說玉米基因組含量比較高，那變性溫度我會(huì)用95度，然后擴(kuò)不出來就用LA taq酶所附帶的GC buffer，醬紫。 |
9樓2011-08-13 21:35:09
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