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duanming123木蟲 (正式寫手)
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[求助]
actin擴(kuò)不出來？
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剛反轉(zhuǎn)錄出的cDNA, actin擴(kuò)不出來，引物沒問題，用的是Mix,模板稀釋了5倍，RNA質(zhì)量還行，是不是模板濃度太高了，在稀釋做做？大家誰遇到種問題？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
adslye(金幣+2): 鼓勵交流~祝順利！ 2011-08-14 09:18:40
duanming123(金幣+1): 5 2011-08-14 17:10:37
duanming123(金幣+2): 2011-08-16 19:52:31
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duanming123(金幣+2): 2011-08-16 19:52:31
以20ugRNA反轉(zhuǎn)錄起始，一般cDNA稀釋5-10倍后作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，大概23-26個cycle就可以。如果Primer沒有問題，反轉(zhuǎn)錄過程也沒問題，那就是PCR不work了，檢查PCR所使用的各個組分有沒有問題。同時也要確保你的反轉(zhuǎn)錄過程是好的。Actin是很容易擴(kuò)的。 |
2樓2011-08-14 01:55:43
qingyuansw20
金蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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adslye(金幣+1): 反轉(zhuǎn)錄一般20Ul體系2ugRNA沒問題，cdna可以電泳看 2011-08-14 09:20:42
adslye(金幣+1): 鼓勵交流，cdna跑電泳沒意義 2011-08-14 09:22:36
duanming123(金幣+1): 5 2011-08-14 17:10:49
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duanming123(金幣+1): 5 2011-08-14 17:10:49
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1、RNA濃度問題，不知道你測定RNA濃度了嗎？一個反轉(zhuǎn)錄體系RNA濃度要求在500ng以內(nèi)。高了不行。超了引物濃度還怎么擴(kuò)？一般我提出的總RNA，要稀釋20倍以上。 2、CDNA沒成，建議反轉(zhuǎn)錄后做個電泳看下，CDNA電泳一條帶。 3、PCR時，內(nèi)參相當(dāng)容易出。按著說明書就能出。我分析是你前面的問題。 |
3樓2011-08-14 08:43:44
adslye
銀蟲 (正式寫手)
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7樓2012-03-29 15:24:46
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