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huangwensh

木蟲 (著名寫手)

[交流] 【求助/交流】western 曝光actin正常，但是樣品卻曝不出來

western 曝光actin正常，但是樣品卻曝不出來，樣品整張膜都發(fā)光，我試過一抗的濃度從1:500到1:3000都是這種情況，封閉時(shí)間最長(zhǎng)的時(shí)候封閉過夜，卻還是整張膜都發(fā)光（一抗二抗都用TBST洗三遍每遍15分鐘），請(qǐng)問各位是哪里出的問題
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feng__

金蟲 (著名寫手)
★
huangwensh(金幣+1): 2011-01-07 10:19:19
最愛花詩(shī)雨(金幣+1):good 2011-01-07 10:23:09
是不是樣品有問題，或者樣品處理過程中有問題

再就是抗體了

一抗我們做一般都是1；400

二抗1；4000
2樓2011-01-07 10:05:27
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huangwensh

木蟲 (著名寫手)
引用回帖:
Originally posted by feng__ at 2011-01-07 10:05:27:
是不是樣品有問題，或者樣品處理過程中有問題

再就是抗體了

一抗我們做一般都是1；400

二抗1；4000

那我的actin曝出來都很正常，樣品是不是不該有問題��？
3樓2011-01-07 10:18:59
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feng__

金蟲 (著名寫手)
★ ★
dhd997(金幣+2):good 2011-01-07 16:40:31
huangwensh(金幣+3): 2011-01-07 16:58:42
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-07 10:18:59:



那我的actin曝出來都很正常，樣品是不是不該有問題��？

恩，考慮下抗體的問題，再多做幾次，有的時(shí)候是這樣的，當(dāng)時(shí)我跟同學(xué)在一塊膠上跑樣品，我的結(jié)果就很好，他的就出不來，后來再做就又出來了，也不知道到底是哪里出問題了，還有，你的樣品是什么��？細(xì)胞表達(dá)的蛋白嗎？如果是的話，分清楚是胞外表達(dá)還是胞內(nèi)，核內(nèi)，如果是后者，那actin表達(dá)，你的樣品不表達(dá)也是正常的，要破碎細(xì)胞壁，細(xì)胞核！呵呵，自己的一點(diǎn)小經(jīng)驗(yàn)
4樓2011-01-07 10:38:07
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huangwensh

木蟲 (著名寫手)
引用回帖:
Originally posted by feng__ at 2011-01-07 10:38:07:


恩，考慮下抗體的問題，再多做幾次，有的時(shí)候是這樣的，當(dāng)時(shí)我跟同學(xué)在一塊膠上跑樣品，我的結(jié)果就很好，他的就出不來，后來再做就又出來了，也不知道到底是哪里出問題了，還有，你的樣品是什么�。考�(xì)胞表達(dá)的 ...

我做的是總蛋白，我都做了一個(gè)多月了，每次都是這樣，都是一整張膜都在發(fā)光，不管我用多大濃度的一抗和二抗洗多長(zhǎng)時(shí)間，封閉多長(zhǎng)時(shí)間，哎
5樓2011-01-07 16:59:56
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feng__

金蟲 (著名寫手)
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-07 16:59:56:


我做的是總蛋白，我都做了一個(gè)多月了，每次都是這樣，都是一整張膜都在發(fā)光，不管我用多大濃度的一抗和二抗洗多長(zhǎng)時(shí)間，封閉多長(zhǎng)時(shí)間，哎

整張膜發(fā)亮還真沒遇見過#35
6樓2011-01-07 18:09:31
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pidou213

木蟲 (正式寫手)
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-06 21:30:41:
western 曝光actin正常，但是樣品卻曝不出來，樣品整張膜都發(fā)光，我試過一抗的濃度從1:500到1:3000都是這種情況，封閉時(shí)間最長(zhǎng)的時(shí)候封閉過夜，卻還是整張膜都發(fā)光（一抗二抗都用TBST洗三遍每遍15分鐘），請(qǐng)問各位 ...

你是怎么做一抗從1：500到1：3000的呢?是不是要做很多張膜�。�

每張膜上有幾個(gè)樣品呢?

請(qǐng)指教
7樓2011-01-10 08:52:03
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zx1984

木蟲 (正式寫手)
★
dhd997(金幣+1):鼓勵(lì)交流 2011-01-10 09:04:52
huangwensh(金幣+1): 2011-01-10 11:01:00
可能二抗有問題，這種情況我也有過，重新買二抗試試。
8樓2011-01-10 08:57:36
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xuqingchun33

銀蟲 (小有名氣)
增加一抗?jié)舛?:20       1:50     1：100
9樓2011-01-10 09:14:30
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xuqingchun33

銀蟲 (小有名氣)
有可能是封閉液的問題
10樓2011-01-10 09:16:12
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huangwensh

木蟲 (著名寫手)
引用回帖:
Originally posted by zx1984 at 2011-01-10 08:57:36:
可能二抗有問題，這種情況我也有過，重新買二抗試試。

二抗我們實(shí)驗(yàn)室大家都用一樣的，其他同學(xué)都沒出現(xiàn)問題呀，二抗的濃度，我也試了好幾個(gè)效果都是一樣的呢，
11樓2011-01-10 11:02:16
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huangwensh

木蟲 (著名寫手)
引用回帖:
Originally posted by xuqingchun33 at 2011-01-10 09:14:30:
增加一抗?jié)舛?:20       1:50     1：100

不好意思金幣發(fā)完了，這會(huì)不會(huì)太大了啊，說明書上推薦的一抗?jié)舛茸畲笫?:300
12樓2011-01-10 11:03:54
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huangwensh

木蟲 (著名寫手)
引用回帖:
Originally posted by xuqingchun33 at 2011-01-10 09:16:12:
有可能是封閉液的問題

不好意思金幣發(fā)完了，我用的是脫脂奶粉5%的，我們實(shí)驗(yàn)室其他人都用這個(gè)沒有這個(gè)問題，封閉時(shí)間我也從1小時(shí)試到過夜封閉效果都一樣的呢
13樓2011-01-10 11:05:23
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huangwensh

木蟲 (著名寫手)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-01-10 08:52:03:



你是怎么做一抗從1：500到1：3000的呢?是不是要做很多張膜啊？

每張膜上有幾個(gè)樣品呢?

請(qǐng)指教

是的我做了好多次，這些濃度都試過了，每張膜上剛開始是8個(gè)樣，后來?xiàng)l件老不對(duì)，我怕浪費(fèi)樣品就每張膜上上了四個(gè)樣了，
14樓2011-01-10 11:09:41
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★ ★
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
reasonspare(金幣+1):謝謝分享。 2011-01-12 07:55:37
一，蛋白的豐度夠不夠
二，確保一抗沒問題
三，蛋白大小，這個(gè)影響轉(zhuǎn)膜的效率
15樓2011-01-10 11:44:59
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huangwensh

木蟲 (著名寫手)
★ ★
reasonspare(金幣+2):雖然你是求助者，但是積極的交流也是值得2金幣相送。 2011-01-12 07:56:57
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2011-01-10 11:44:59:
一，蛋白的豐度夠不夠
二，確保一抗沒問題
三，蛋白大小，這個(gè)影響轉(zhuǎn)膜的效率

謝謝，不好意思沒金幣贈(zèng)送了，呵呵，前兩個(gè)問題我不太確定，第三個(gè)問題，我想轉(zhuǎn)膜應(yīng)該問題不大，因?yàn)槲业膍arker轉(zhuǎn)的不錯(cuò)，我想蛋白應(yīng)該 轉(zhuǎn)上了，我再考慮一下前兩個(gè)問題，謝謝
16樓2011-01-10 16:13:53
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pidou213

木蟲 (正式寫手)
★
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-10 16:13:53:

  
謝謝，不好意思沒金幣贈(zèng)送了，呵呵，前兩個(gè)問題我不太確定，第三個(gè)問題，我想轉(zhuǎn)膜應(yīng)該問題不大，因?yàn)槲业膍arker轉(zhuǎn)的不錯(cuò)，我想蛋白應(yīng)該 轉(zhuǎn)上了，我再考慮一下前兩個(gè)問題，謝謝

我的marker轉(zhuǎn)的也不錯(cuò)，但是麗春紅染色效果好差啊
17樓2011-01-10 20:38:41
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pidou213

木蟲 (正式寫手)
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-10 11:09:41:


是的我做了好多次，這些濃度都試過了，每張膜上剛開始是8個(gè)樣，后來?xiàng)l件老不對(duì)，我怕浪費(fèi)樣品就每張膜上上了四個(gè)樣了，

那一定需要好多膜吧？還有你做麗春紅染色鑒定嗎？
18樓2011-01-10 20:39:22
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huangwensh

木蟲 (著名寫手)
★ ★
reasonspare(金幣+2):謝謝分享。 2011-01-12 07:57:13
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-01-10 20:39:22:



那一定需要好多膜吧？還有你做麗春紅染色鑒定嗎？

我一般不鑒定，有時(shí)候也鑒定，如果有蛋白會(huì)有條帶，是需要好多膜，呵呵，我用的是PVDF膜，但是我做的是大分子，一直沒爆出來，所以下次我想改用NC膜做一次，聽說NC膜親和力比pvdf膜好一些，
19樓2011-01-11 10:18:34
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huangwensh

木蟲 (著名寫手)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-01-10 20:38:41:



我的marker轉(zhuǎn)的也不錯(cuò)，但是麗春紅染色效果好差啊

那會(huì)不會(huì)是你提的蛋白質(zhì)量不行啊，
20樓2011-01-11 10:19:53
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dianaofyezi

金蟲 (正式寫手)
★
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
你將蛋白直接點(diǎn)在NC膜上，做個(gè)雜交看見能出來不。
21樓2011-01-11 11:27:05
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pidou213

木蟲 (正式寫手)
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-11 10:19:53:


那會(huì)不會(huì)是你提的蛋白質(zhì)量不行啊，

我加陽(yáng)性對(duì)照了啊
22樓2011-01-12 00:15:04
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pidou213

木蟲 (正式寫手)
reasonspare:哈哈，就是雜教預(yù)試驗(yàn)，用來監(jiān)測(cè)你的抗體的有效性，蛋白樣品不用分離，直接點(diǎn)膜，剩下的WB的步驟一樣。有信號(hào)說明抗體還可以（但不排除非特意） 2011-01-12 08:00:20
引用回帖:
Originally posted by dianaofyezi at 2011-01-11 11:27:05:
你將蛋白直接點(diǎn)在NC膜上，做個(gè)雜交看見能出來不。

怎么做雜交？
23樓2011-01-12 00:15:28
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huangwensh

木蟲 (著名寫手)
引用回帖:
Originally posted by zx1984 at 2011-01-10 08:57:36:
可能二抗有問題，這種情況我也有過，重新買二抗試試。

我的師姐們和我用的都是同樣的二抗，但是他們都做出來了，這樣可不可以排除二抗有問題？
24樓2011-01-12 11:10:30
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zx1984

木蟲 (正式寫手)
★
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
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Originally posted by huangwensh at 2011-01-12 11:10:30:


我的師姐們和我用的都是同樣的二抗，但是他們都做出來了，這樣可不可以排除二抗有問題？

那二抗就應(yīng)該沒問題，看看一抗孵育過夜試試，不行就換一抗，再不行就是樣品可能有問題，沒辦法，western一旦這樣就只能一步步的排除原因。
25樓2011-01-12 12:31:35
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huangwensh

木蟲 (著名寫手)
引用回帖:
Originally posted by zx1984 at 2011-01-12 12:31:35:

那二抗就應(yīng)該沒問題，看看一抗孵育過夜試試，不行就換一抗，再不行就是樣品可能有問題，沒辦法，western一旦這樣就只能一步步的排除原因。

我現(xiàn)在除了一抗沒換其他的都試過了，那看來真的是一抗有問題，哎，這是我最不想見到的
26樓2011-01-12 13:05:22
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lstt09nk

鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
★ ★ ★
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scelab(金幣+2):忽忽~~~ 2011-01-15 01:38:44
整張膜都顯色我覺得是封閉沒做好，封閉是怎么做的？封閉的時(shí)候一定要搖，靜置封閉的效果不算太好，當(dāng)然也可以先在搖床上搖，然后4度靜置封閉過夜
還有一種可能就是膜沒洗干凈，下次洗的時(shí)候TBST現(xiàn)配現(xiàn)用，而且一抗洗的時(shí)間可以稍微長(zhǎng)一點(diǎn)，洗干凈是很關(guān)鍵的
27樓2011-01-12 13:33:26
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huangwensh

木蟲 (著名寫手)
引用回帖:
Originally posted by lstt09nk at 2011-01-12 13:33:26:
整張膜都顯色我覺得是封閉沒做好，封閉是怎么做的？封閉的時(shí)候一定要搖，靜置封閉的效果不算太好，當(dāng)然也可以先在搖床上搖，然后4度靜置封閉過夜
還有一種可能就是膜沒洗干凈，下次洗的時(shí)候TBST現(xiàn)配現(xiàn)用，而且一 ...

TBST需要現(xiàn)用現(xiàn)配？這個(gè)我都是陪2L然后能用一星期吧，封閉液是5%的脫脂奶粉，這個(gè)事現(xiàn)用現(xiàn)配的，
28樓2011-01-12 15:05:45
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lstt09nk

鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
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Originally posted by huangwensh at 2011-01-12 15:05:45:

TBST需要現(xiàn)用現(xiàn)配？這個(gè)我都是陪2L然后能用一星期吧，封閉液是5%的脫脂奶粉，這個(gè)事現(xiàn)用現(xiàn)配的，

沒有說一定要先用現(xiàn)配，但是放時(shí)間長(zhǎng)了效果會(huì)不好。這樣的話，膜會(huì)洗不干凈
29樓2011-01-14 18:24:48
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kebo050551

新蟲 (初入文壇)
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樣品和ACTIN的二抗是一樣的嗎？ 如果不一樣就可能是二抗有問題，我做actin的二抗是鼠抗，抗體非常不好用，背景很黑，
30樓2011-01-14 20:18:20
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huangwensh

木蟲 (著名寫手)
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Originally posted by lstt09nk at 2011-01-14 18:24:48:

沒有說一定要先用現(xiàn)配，但是放時(shí)間長(zhǎng)了效果會(huì)不好。這樣的話，膜會(huì)洗不干凈

哦，知道啦，謝謝，呵呵
31樓2011-01-15 13:33:55
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huangwensh

木蟲 (著名寫手)
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Originally posted by kebo050551 at 2011-01-14 20:18:20:
樣品和ACTIN的二抗是一樣的嗎？ 如果不一樣就可能是二抗有問題，我做actin的二抗是鼠抗，抗體非常不好用，背景很黑，

不一樣，一個(gè)是抗兔的，一個(gè)是抗小鼠的，哦，
32樓2011-01-15 13:34:48
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pidou213

木蟲 (正式寫手)
★
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
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Originally posted by huangwensh at 2011-01-06 21:30:41:
western 曝光actin正常，但是樣品卻曝不出來，樣品整張膜都發(fā)光，我試過一抗的濃度從1:500到1:3000都是這種情況，封閉時(shí)間最長(zhǎng)的時(shí)候封閉過夜，卻還是整張膜都發(fā)光（一抗二抗都用TBST洗三遍每遍15分鐘），請(qǐng)問各位 ...

請(qǐng)問你用的是什么公司的試劑盒？

推薦用量是多少？
33樓2011-01-15 13:49:17
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pidou213

木蟲 (正式寫手)
引用回帖:
Originally posted by feng__ at 2011-01-07 10:05:27:
是不是樣品有問題，或者樣品處理過程中有問題

再就是抗體了

一抗我們做一般都是1；400

二抗1；4000

你用的是什么公司的一抗啊？為什么用這么高的濃度啊
34樓2011-01-15 13:49:51
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huangwensh

木蟲 (著名寫手)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-01-15 13:49:51:


你用的是什么公司的一抗��？為什么用這么高的濃度啊

abcam的推薦濃度，我買了兩個(gè)一個(gè)是這個(gè)，一個(gè)推薦濃度是10μg/ml-50μg/ml濃度更高啊
35樓2011-01-15 20:10:59
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gaoyanli

銅蟲 (小有名氣)
換個(gè)封閉液試試吧
36樓2011-01-16 22:02:48
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huangwensh

木蟲 (著名寫手)
引用回帖:
Originally posted by gaoyanli at 2011-01-16 22:02:48:
換個(gè)封閉液試試吧

你是說換牛血清白蛋白嗎？？？
37樓2011-01-18 13:00:32
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gaoyanli

銅蟲 (小有名氣)
★
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
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Originally posted by gaoyanli at 2011-01-16 22:02:48:
換個(gè)封閉液試試吧

你可以試一下，我以前也遇到這個(gè)問題，換個(gè)封閉液就好了
38樓2011-01-19 16:58:04
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