wanghuiyanyx

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[求助] RNA樣品中的未除盡基因組DNA

用Qiagen小提試劑盒（包括柱子上DNaseI處理過程）提取細(xì)菌RNA用于芯片，電泳看不到基因組條帶，但是以此樣品作為模板進(jìn)行PCR，卻可以擴(kuò)增出目的片段！這樣的樣品是否還需要再進(jìn)行DNaseI處理？但是擔(dān)心這樣再處理一遍會導(dǎo)致樣品被稀釋，且RNA純度受影響。請高手指教！

[ Last edited by wanghuiyanyx on 2012-2-28 at 22:08 ]

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1樓 2012-02-28 21:33:47

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西瓜(金幣+2): 鼓勵應(yīng)助，補上！ 2012-03-08 18:34:35

擔(dān)心降解可以把RNA沉淀下來再加上無水乙醇進(jìn)行干冰運輸。
其他RNA-seq也沒要求必須除盡DNA吧？芯片就不清楚了
氯仿再抽提一次加上去掉的DNA在OD值上估計會損失40-50%。

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4樓2012-02-29 10:50:35

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longrna

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木(金幣+2): 還是很熱心哦 2012-02-29 10:00:19
wanghuiyanyx(金幣+20): ★★★很有幫助 2012-02-29 10:36:27

用于芯片估計對DNA污染要求很高吧？
個人經(jīng)驗：柱上消化效率不如在溶液體系里加DNase I消化。
既然你都提出來RNA了只能再進(jìn)行DNaseI消化處理一次咯，當(dāng)然，消化處理后用柱子或氯仿抽提一次即可不必?fù)?dān)心純度及濃度的問題（亦可去掉DNaseI）。不過你需要擔(dān)心的是操作得非常謹(jǐn)慎注意，切勿到時把DNA消化干凈了，RNA也跟著去了...
祝好！

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wanghuiyanyx

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2樓2012-02-29 09:16:13

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樓: Originally posted by longrna at 2012-02-29 09:16:13:
用于芯片估計對DNA污染要求很高吧？
個人經(jīng)驗：柱上消化效率不如在溶液體系里加DNase I消化。
既然你都提出來RNA了只能再進(jìn)行DNaseI消化處理一次咯，當(dāng)然，消化處理后用柱子或氯仿抽提一次即可不必?fù)?dān)心純度及濃 ...

謝謝你的建議，我以前做qPCR的時候，提完RNA后用DNaseI處理后直接滅活的，但是用于芯片或RNA-SEQ的話，這樣樣品里會有雜志，擔(dān)心影響下游反應(yīng)及運輸途中降解。想請教一下用氯仿再抽提一次會不會損失很多RNA�。�

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3樓2012-02-29 10:21:51

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引用回帖:

樓: Originally posted by longrna at 2012-02-29 10:50:35:
擔(dān)心降解可以把RNA沉淀下來再加上無水乙醇進(jìn)行干冰運輸。
其他RNA-seq也沒要求必須除盡DNA吧？芯片就不清楚了
氯仿再抽提一次加上去掉的DNA在OD值上估計會損失40-50%。

是的，RNA-seq僅根據(jù)OD和電泳圖判斷質(zhì)量，但是殘存的微量DNA會不會對基因表達(dá)水平分析有影響呢？親愛的longrna ，請教一下有沒有做過RNA-SEQ呢？

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5樓2012-02-29 12:15:54

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wanghuiyanyx(金幣+20): ★★★很有幫助 2012-02-29 18:49:03

我做的RNA-SEQ是取total RNA，然后進(jìn)行mRNA純化（通過oligo（dT）的磁珠），所以測的其實是mRNA. 當(dāng)然，由于受限于特異性，測出來的數(shù)據(jù)肯定會有核糖體RNA的存在，只占比較少的一定比例。

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6樓2012-02-29 12:48:06

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樓: Originally posted by longrna at 2012-02-29 12:48:06:
我做的RNA-SEQ是取total RNA，然后進(jìn)行mRNA純化（通過oligo（dT）的磁珠），所以測的其實是mRNA. 當(dāng)然，由于受限于特異性，測出來的數(shù)據(jù)肯定會有核糖體RNA的存在，只占比較少的一定比例。

我也是打算這么做，就是擔(dān)心所提的total RNA里殘存痕量DNA會不會影響測序結(jié)果中基因表達(dá)變化倍數(shù)？

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7樓2012-02-29 18:48:55

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wanghuiyanyx(金幣+9): 2012-03-08 13:27:59

你要是做芯片或者做RNA-seq，不需要除gDNA的；qPCR需要除一下

PS，現(xiàn)在做deep-sequencing的同志們真多��！

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致良知

8樓2012-03-08 13:03:30

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樓: Originally posted by quiller2000 at 2012-03-08 13:03:30:
你要是做芯片或者做RNA-seq，不需要除gDNA的；qPCR需要除一下

PS，現(xiàn)在做deep-sequencing的同志們真多��！

謝謝解釋，這個問題我昨天也問過公司的技術(shù)支持。回復(fù)也是這樣，在后續(xù)建庫的時候會在進(jìn)行mRNA富集和除DNA。做芯片也很費錢的，qRT-PCT通量小，大量做也是很貴，所以干脆就做測序了。

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9樓2012-03-08 13:53:38

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順道問下樓上的大俠們，我也要做RNA-seq，但是一些樣品先提了RNA在-80度保存，沒法一起提所有的RNA。那么我現(xiàn)在擔(dān)心，前后一個多月的間隔，提好所有的RNA后，最早的會不會降解？Trizol提的。DEPC水溶解的。

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10樓2012-05-08 21:16:40

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