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huangwensh

木蟲 (著名寫手)

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[交流] 【求助/交流】western 曝光actin正常，但是樣品卻曝不出來(lái)

western 曝光actin正常，但是樣品卻曝不出來(lái)，樣品整張膜都發(fā)光，我試過(guò)一抗的濃度從1:500到1:3000都是這種情況，封閉時(shí)間最長(zhǎng)的時(shí)候封閉過(guò)夜，卻還是整張膜都發(fā)光（一抗二抗都用TBST洗三遍每遍15分鐘），請(qǐng)問(wèn)各位是哪里出的問(wèn)題

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1樓 2011-01-06 21:30:41

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feng__

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dhd997(金幣+2):good 2011-01-07 16:40:31
huangwensh(金幣+3): 2011-01-07 16:58:42

引用回帖:

Originally posted by huangwensh at 2011-01-07 10:18:59:

那我的actin曝出來(lái)都很正常，樣品是不是不該有問(wèn)題��？

恩，考慮下抗體的問(wèn)題，再多做幾次，有的時(shí)候是這樣的，當(dāng)時(shí)我跟同學(xué)在一塊膠上跑樣品，我的結(jié)果就很好，他的就出不來(lái)，后來(lái)再做就又出來(lái)了，也不知道到底是哪里出問(wèn)題了，還有，你的樣品是什么�。考�(xì)胞表達(dá)的蛋白嗎？如果是的話，分清楚是胞外表達(dá)還是胞內(nèi)，核內(nèi)，如果是后者，那actin表達(dá)，你的樣品不表達(dá)也是正常的，要破碎細(xì)胞壁，細(xì)胞核！呵呵，自己的一點(diǎn)小經(jīng)驗(yàn)

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4樓2011-01-07 10:38:07

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最愛(ài)花詩(shī)雨(金幣+1):good 2011-01-07 10:23:09

是不是樣品有問(wèn)題，或者樣品處理過(guò)程中有問(wèn)題

再就是抗體了

一抗我們做一般都是1；400

二抗1；4000

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2樓2011-01-07 10:05:27

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引用回帖:

Originally posted by feng__ at 2011-01-07 10:05:27:
是不是樣品有問(wèn)題，或者樣品處理過(guò)程中有問(wèn)題

再就是抗體了

一抗我們做一般都是1；400

二抗1；4000

那我的actin曝出來(lái)都很正常，樣品是不是不該有問(wèn)題�。�

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3樓2011-01-07 10:18:59

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Originally posted by feng__ at 2011-01-07 10:38:07:

恩，考慮下抗體的問(wèn)題，再多做幾次，有的時(shí)候是這樣的，當(dāng)時(shí)我跟同學(xué)在一塊膠上跑樣品，我的結(jié)果就很好，他的就出不來(lái)，后來(lái)再做就又出來(lái)了，也不知道到底是哪里出問(wèn)題了，還有，你的樣品是什么啊？細(xì)胞表達(dá)的 ...

我做的是總蛋白，我都做了一個(gè)多月了，每次都是這樣，都是一整張膜都在發(fā)光，不管我用多大濃度的一抗和二抗洗多長(zhǎng)時(shí)間，封閉多長(zhǎng)時(shí)間，哎

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5樓2011-01-07 16:59:56

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