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禽流感的分離方法
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| 請各位指點(diǎn)一二: 我從鴨場采集的病料分離禽流感病毒(臨床疑似禽流感),第一次未分離到病毒,第二次我采集了 肝 脾 心臟 腦 還是未分離到病毒。請問這是為什么呢? 分離病毒的方法都有哪些呢? |
| 采集氣管粘液或泄殖腔粘液,或病變組織(呼吸道、消化道),加純水制作勻漿(10%懸液),低速冷凍離心機(jī)(臺(tái)式或立式均可)3,000~4,000rpm, 4℃~5℃,15~20分,棄沉淀,即得到粗制的病毒液,可用負(fù)染法處理(用毛細(xì)管吸取懸液,滴在帶有支持膜的銅網(wǎng)上,根據(jù)懸液內(nèi)樣品的濃度可立即或放置數(shù)分鐘后,用濾紙從液珠邊緣吸去多余液體,然后滴上負(fù)染液(常用重金屬鹽配置:如PTA(磷鎢酸)、KPT(磷鎢酸鉀)、NaPT (磷鎢酸鈉)、醋酸鈉、甲酸鈉、鉬酸銨等等)、染色時(shí)間1~2分鐘,然后用濾紙吸去染液,待干燥后上透射電鏡觀測。如果粗制液中病毒成份極少,透射電鏡觀測不到,則可把懸液用離心濃縮儀濃縮;或用超速離心機(jī),固定角式轉(zhuǎn)頭40,000rpm ×45 分鐘,5℃取沉淀制成懸液上電鏡觀測;蛴40,000rpm的甩平轉(zhuǎn)頭,30%~50%W/W 線性蔗糖梯度32,000rpm×50 分,5℃,病毒集聚在1.15~1.18g/cm3之間的某個(gè)位置形成純樣品區(qū)帶;或用Ficoll,30%~40%W/W 線性梯度,病毒沉降在1.13~1.15g/cm3之間;或用Percoll作平衡等密度離心,自形成梯度,病毒懸液與Percoll混合,初始密度1.05g/cm3,用0.01M Tris-HCL作滲透平衡液,日立超速離心甩平轉(zhuǎn)頭P28S(上海天美肯公司購自)或SW28(貝克曼)轉(zhuǎn)頭,20,000rpm×30分鐘,5℃。病毒在1.06 g/cm3附近形成純樣品區(qū)帶。當(dāng)然,也可以用溴化鈉(鉀)或碘化鈉(鉀)梯度進(jìn)行禽流感病毒的純化。 |

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